Manual do usuário do SAMURAI 3

1Visão geral do sistema

O Katana é um micrótomo serial de face de bloco. Ele cabe dentro da câmara de vácuo de um microscópio eletrônico de varredura (SEM). Um PC com o software Samurai 3 controla o micrótomo e o microscópio em conjunto, de modo que os dois funcionam como um único instrumento. Juntos, eles adquirem a imagem da superfície de uma amostra incluída em resina, removem um corte fino, adquirem a imagem da nova superfície e repetem o processo. Isso pode durar horas ou semanas, sem que ninguém precise tocar em nada.

Micrótomo

Controlador eletrônico

Digital Viewer

1.1 Como funciona o imageamento serial de face de bloco

A microscopia eletrônica de varredura serial de face de bloco (SBF-SEM) constrói uma imagem 3D de uma amostra, uma camada de cada vez. Cada repetição é chamada de ciclo:

1. Imagem. O SEM varre a superfície superior exposta da amostra, chamada de face do bloco. Ele registra uma imagem por tile.
2. Corte. A navalha de diamante passa pela face do bloco e remove um corte fino. Um corte costuma ter 20–100 nm de espessura.
3. Elevação. O micrótomo eleva a amostra em uma espessura de corte. Assim, a nova face do bloco fica exatamente no mesmo plano de corte, a altura em que a navalha corta.

As imagens são empilhadas na ordem de corte. Juntas, elas formam um volume 3D.

1.2 O hardware

Micrótomo. A unidade que fica dentro da câmara. Ele segura a amostra em um pino de amostra e a eleva com uma platina Z de precisão. Ele corta com uma navalha de diamante que oscila (vibra para a frente e para trás). O micrótomo fica sobre um adaptador de platina, na platina do SEM. Ele se conecta ao exterior pelo flange da câmara, uma placa de conectores vedada na parede da câmara.

Controlador eletrônico. A caixa que fica fora do microscópio. Ele alimenta o micrótomo e aciona seus motores e o oscilador da navalha. Ele se comunica com o PC do Samurai via USB.

Digital Viewer. Uma câmera óptica removível. Ela fica sobre o micrótomo enquanto você leva uma nova amostra até a navalha. Essa etapa se chama aproximação (capítulo 9, “A aproximação”). Você retira a câmera antes de fechar a câmara.

O Samurai também pode controlar equipamentos opcionais:

• Agulha PCN — uma agulha motorizada com controlador próprio. Ela fica perto da área imageada para reduzir o carregamento (um acúmulo de elétrons que estraga a imagem). Consulte o capítulo 20, “A agulha PCN”.
• Detector EDS — Oxford Instruments AZtec. Ele faz mapas elementares dos tiles que você escolher. Consulte o capítulo 22, “Mapas de EDS com o Oxford AZtec”.

1.3 O software

O Samurai 3 é executado no PC hospedeiro. Ele tem três espaços de trabalho. Você escolhe um deles pelas abas no topo da janela:

O Samurai não se comunica diretamente com o microscópio. Um pequeno programa complementar fica entre os dois: a Universal SEM Bridge. Ela é executada no PC do microscópio ou em um PC ao lado dele. Ela usa a interface do próprio fabricante do microscópio. Assim, o Samurai recebe uma conexão que funciona sempre da mesma forma, seja qual for a marca. Para fazer a conexão, consulte o capítulo 7, “Conectar os seus equipamentos”.

1.4 Palavras que você vai encontrar em toda parte

A lista completa está no capítulo 38, “Glossário”.

2O micrótomo e seu controlador

2.1 Partes do micrótomo

O micrótomo é a parte que vai para dentro da câmara do SEM. Ele segura a amostra em um pino e a eleva com uma platina de precisão. Ele corta a amostra com uma navalha de diamante que oscila (vibra para a frente e para trás).

Vista superior

Vista lateral

Vista inferior

2.2 O controlador eletrônico

O controlador fica fora do microscópio. Ele alimenta o micrótomo e aciona seus motores e o oscilador da navalha. Ele também se conecta ao PC do Samurai.

1. Portas USB — conecte aqui o PC do Samurai. Você também pode conectar outros instrumentos, se a sua configuração precisar deles.
2. Conector principal — conecta-se ao flange de passagem da câmara. Dentro da câmara, o cabo interno vai do flange até o conector principal do micrótomo.
3. Entrada de 48 V — somente para a fonte de alimentação de 48 V fornecida.
4. Interruptor principal — liga e desliga a alimentação.

2.3 O Digital Viewer

O Digital Viewer é uma câmera óptica. Ele se encaixa no micrótomo enquanto a câmara está aberta. Com ele, você observa a navalha e a face do bloco durante a aproximação, enquanto você as aproxima uma da outra (capítulo 9, “A aproximação”). A imagem dele aparece na aba Approach.

3Instalação

O micrótomo fica dentro da câmara de vácuo do SEM. Por isso, instalá-lo depende principalmente de duas coisas: manter tudo limpo e garantir que nada dentro da câmara possa bater nele.

3.1 Mantenha tudo limpo

O micrótomo deve estar livre de contaminação. O mesmo vale para todas as peças que vão para o vácuo: o flange, o adaptador da platina e o cabo interno da câmara. O flange é a placa de conectores vedada na parede da câmara. Se essas peças não estiverem limpas, o vácuo e a qualidade de imagem do microscópio são prejudicados.

• Use luvas novas sempre que manusear o micrótomo ou seus acessórios.
• Se você notar contaminação, limpe-a delicadamente com um lenço que não solte fiapos, umedecido com isopropanol.
• Deixe todas as superfícies secarem completamente, sem resíduos, antes de irem para a câmara.

3.2 Abra espaço na câmara

O micrótomo é grande em comparação com a maioria dos porta-amostras. Antes de instalá-lo:

1. Retire os detectores que você não vai usar. Recolha os detectores que permanecem e trave-os para que não possam ser movidos contra o micrótomo. Use as travas mecânicas deles ou desative a inserção no software do microscópio.
2. Verifique o espaço sob o detector de elétrons retroespalhados (BSED). Meça da face superior do adaptador de platina fornecido até o ponto mais baixo do BSED. Esse espaço deve ser de mais de 56 mm, que é a altura do micrótomo.
3. Retire os acessórios padrão da platina, como porta-amostras e grampos, se estiverem atrapalhando. Alguns modelos de SEM exigem isso.

3.3 Monte o micrótomo

1. Coloque o micrótomo sobre o adaptador de platina fornecido. Aperte o parafuso manual da platina, na parte de trás (peça 10 na seção 2.1).
2. Passe o cabo interno até o flange de passagem da câmara. Posicione o cabo de modo que nenhum movimento da platina possa puxá-lo, prensá-lo ou dobrá-lo para dentro do caminho da navalha.
3. Fora da câmara, conecte o flange ao conector principal do controlador.
4. Conecte ao controlador a fonte de alimentação de 48 V fornecida.
5. Conecte o controlador ao PC do Samurai com um cabo USB.
6. Ligue o controlador.

3.4 Verifique se o Samurai reconhece o micrótomo

1. Inicie o Samurai. Se Auto-connect Microtome (conectar o micrótomo automaticamente) estiver ativado (o padrão), o Samurai se conecta sozinho. Se não estiver, clique no indicador Microtome no rodapé (seção 7.3).
2. Quando o indicador ficar verde, a posição Z aparece na aba Approach.
3. Verifique se a câmara está aberta e se a área ao redor da amostra está livre. Depois, execute Find Zero para dar à platina o seu ponto de referência (seção 9.2).

Agora você está pronto para montar uma amostra (capítulo 4, “Preparação da amostra”) e fazer a aproximação (capítulo 9, “A aproximação”).

4Preparação da amostra

4.1 Monte a amostra em um pino

As amostras são coladas em pinos de amostra de alumínio. Uma amostra bem montada é rígida, condutora e tem a altura certa. Cada um desses fatores afeta a qualidade do corte e da imagem.

• Fixe-a com firmeza. Cole a amostra no pino com supercola ou epóxi condutor, para que ela não possa se mover durante o corte.
• Garanta um caminho condutor. A carga precisa conseguir escoar da amostra para o pino. Por exemplo, recubra a amostra com um material condutor por sputtering.
• Respeite a faixa de altura. A parte superior do pino tem 2 mm de altura. A amostra mais essa parte superior deve medir 2,1–3,3 mm. Assim, uma amostra de 0,1–1,2 mm de altura é ideal, e 1,3 mm é o máximo.
• Amostras mais altas precisam de um pino com a parte superior mais curta. Esse pino está disponível como alternativa. Amostras mais altas são menos estáveis e podem ter cortes menos limpos.
• Amostras com menos de 0,1 mm: se você quiser cortar os últimos 100 µm da amostra, coloque um espaçador fino (0,5 mm) sob ela.

4.2 Insira, prenda e retire o pino

1 Inserir

2 Prender

3 Retirar

Para inserir e prender o pino:

1. Retire o protetor de plástico transparente da navalha, mas apenas pelo tempo necessário para manusear o pino.
2. Empurre o pino de amostra para dentro do orifício dele na platina de amostra. Pressione-o com firmeza para que ele se encaixe totalmente no orifício.
3. Por baixo, coloque a chave de fenda fornecida no orifício de acesso (peça 9). Gire o parafuso de fixação no sentido horário, apenas com os dedos, até ficar apertado à mão.
4. Recoloque o protetor da navalha.

Para retirar o pino: gire o parafuso de fixação no sentido anti-horário até sentir resistência. Depois, gire-o meia volta no sentido horário para liberar o pino. Levante o pino para retirá-lo.

5Manutenção

5.1 Troque a navalha

1. Desconecte o micrótomo no Samurai, desligue o controlador e desconecte o cabo interno do micrótomo.
2. Segure o suporte da navalha firmemente no sentido das setas enquanto retira os dois parafusos sextavados. Segurá-lo dessa forma evita que qualquer força atue sobre o mecanismo de corte.
3. Não levante o suporte diretamente para cima. Isso pode danificar o conector elétrico dele. Em vez disso, faça alavanca delicadamente por baixo com uma chave de fenda ou uma ferramenta parecida. Isso desconecta o conector.
4. Não toque nos contatos elétricos e não os coloque em curto-circuito.
5. Instale o novo suporte da navalha na ordem inversa. Reconecte o cabo e ligue o controlador.
6. Faça novamente a aproximação da amostra antes de cortar, porque a navalha mudou (capítulo 9, “A aproximação”).

5.2 Cuide da navalha de diamante

• Mantenha o protetor de plástico transparente sobre a navalha sempre que não estiver cortando nem manuseando a amostra.
• Nunca toque no fio do diamante. Mantenha pinças, cola e detritos soltos longe dele.
• Depois da aproximação e antes de fechar a câmara, remova com um sopro os detritos da face do bloco. Use um jato suave de ar seco ou nitrogênio.

5.3 Mantenha limpas as peças de vácuo

Use luvas novas sempre que manusear o micrótomo, o cabo interno da câmara ou o adaptador da platina. Se essas peças ficarem contaminadas, limpe-as com um lenço que não solte fiapos, umedecido com isopropanol. Deixe-as secar completamente antes de voltarem para a câmara (seção 3.1).

5.4 Firmware do controlador

O controlador do micrótomo executa seu próprio firmware, o software embutido no controlador. Um engenheiro de serviço instala as atualizações em Settings › Microtome › Controller Firmware. Você também pode instalar uma atualização se o suporte pedir. Antes de gravar qualquer coisa, o Samurai verifica se o arquivo de firmware realmente pertence ao seu controlador (capítulo 34, “Referência das configurações”). Não atualize o firmware no meio de um experimento.

6O Samurai em resumo

6.1 Iniciar o Samurai

Inicie o Samurai3 pela área de trabalho ou pelo menu Iniciar. Uma breve tela "Loading Samurai 3…" aparece enquanto o software inicia seu serviço de hardware. O serviço de hardware é o programa em segundo plano que controla seus equipamentos.

O que você vê em seguida depende de como o Samurai foi fechado:

• Havia um experimento aberto da última vez e Settings › General › Restore Previous Experiment está ativado (o padrão): o Samurai reabre esse experimento. Ele muda para a aba Imaging e mostra Restored previous experiment (experimento anterior restaurado).
• Não há experimento para restaurar: o Samurai abre na aba Approach.

Ao mesmo tempo, o Samurai reconecta seus equipamentos:

• O micrótomo. O indicador mostra Connecting... enquanto o Samurai faz quatro tentativas, ao longo de cerca de dez segundos.
• O SEM, assim que a SEM Bridge informa que o microscópio dela está conectado.
• O PCN, mas somente se você tiver ativado Auto-connect PCN.

Para ver os detalhes de cada conexão, consulte o capítulo 7, “Conectar os seus equipamentos”.

6.2 A janela

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1. Abas dos espaços de trabalho — Approach, Imaging e, se estiver ativado, Studio.
2. Barra lateral esquerda — o experimento, o progresso da aquisição e as configurações do micrótomo.
3. Área de visualização — sua amostra, regiões e imagens. A barra de ferramentas fica na parte inferior.
4. Barra lateral direita — Time Travel, ROIs, SEM, foco automático, PCN e outros painéis.
5. Rodapé — configurações, manual, console e indicadores de conexão.

Você usa as três abas nesta ordem:

Trocar de aba nunca interrompe nada. Cada aba mantém o seu estado, e uma aquisição em andamento continua enquanto você olha o Studio. Uma exceção: a transmissão do Digital Viewer é pausada enquanto a aba Approach está oculta.

Para expandir ou recolher um painel da barra lateral, clique no título dele. Se algum controle parecer estar faltando, role a barra lateral. Barras laterais longas continuam abaixo da borda da janela.

6.3 O rodapé

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1. Versão do Samurai.
2. Settings — todas as preferências (capítulo 34, “Referência das configurações”).
3. User Manual — abre este manual no seu navegador.
4. Chip AI agent — o servidor MCP, que permite que agentes de IA externos se conectem ao Samurai (capítulo 24, “Como trabalhar com agentes de IA”).
5. Console — mostra o número de erros em vermelho e de avisos em amarelo.
6. Indicador PCN — só aparece quando o módulo PCN está ativado.
7. Indicador SEM e SEM Connection Settings.
8. Indicador Microtome.
9. Indicador do cabo — mostra se o cabo e o encoder do micrótomo estão OK. O encoder é o sensor que mede o Z.

Na aba Studio, o rodapé também mostra Search (Spotlight, Ctrl/⌘+K). Enquanto o Studio está trabalhando, o rodapé mostra uma barra de progresso com o nome da tarefa. A seção 7.4 explica os indicadores.

6.4 O console

Clique no botão Console no rodapé. O console se abre sobre a metade direita da janela. Arraste a borda superior dele para aumentar a altura. Clique na seta (chevron) para fechá-lo.

O Samurai copia para o console cada notificação que aparece, para que você possa lê-la de novo mais tarde. Avisos e erros são escritos em linguagem simples. Os detalhes técnicos vão para o arquivo de log. O ícone de copiar copia a aba atual, e o ícone de lixeira a limpa.

6.5 Quando o Samurai está ocupado

• Cursor de ocupado. Enquanto o Samurai grava no banco de dados do experimento, o ponteiro mostra um pequeno indicador giratório. O Samurai retém os seus cliques por um instante. Isso é normal e geralmente dura uma fração de segundo.
• DB updating... Se uma gravação bloquear a interface por mais de três segundos, aparece no topo uma etiqueta amarela: DB updating... (double-click to force unlock) (atualizando o banco de dados… clique duas vezes para forçar o desbloqueio). Um clique duplo libera apenas a interface. O trabalho continua em segundo plano. Use-o somente se o Samurai parecer travado.
• Operações longas mostram um cartão no topo com uma linha de progresso em tempo real e um botão ✕ para cancelar. A sincronização do gating de tiles (gravar quais tiles devem ser pulados) é um exemplo.
• Fundo da janela vermelho. Se o sistema operacional informar que a janela parou de responder, o fundo fica vermelho-escuro até a janela se recuperar. O console registra por quanto tempo ela ficou congelada.

6.6 Notificações

As notificações aparecem no canto inferior direito. A maioria desaparece sozinha. As importantes permanecem até você fechá-las. Algumas trazem uma ação, como Reconnect, Clear PCN fault (limpar a falha do PCN) ou Clear cut record (limpar o registro de corte). O console também guarda todas as notificações.

6.7 Fechar o Samurai

Feche a janela normalmente. O Samurai pergunta Close Samurai? Clique em Close para confirmar. Se o Studio tiver alterações não salvas, o Samurai as salva primeiro e mostra "Saving Studio changes before closing…". Se esse salvamento falhar, o Samurai permanece aberto, para que nada se perca.

6.8 Arquivos de log

O Samurai grava um arquivo de log a cada vez que é iniciado. O log usa o horário local. O suporte geralmente vai pedir esse arquivo.

O arquivo se chama app-<date>T<time>.log. Quando o Samurai inicia, os logs anteriores são movidos para a subpasta old.

6.9 Requisitos do sistema

7Conectar os seus equipamentos

O Samurai se comunica com três tipos de equipamento, cada um à sua maneira:

• o microscópio, pela Universal SEM Bridge
• o controlador do micrótomo, via USB ou, no caso de um simulador, pela rede (TCP)
• acessórios opcionais, pelos seus próprios painéis: a agulha PCN, o detector Kensho e o EDS

7.1 A Universal SEM Bridge

A SEM Bridge é um pequeno programa complementar. Ela é executada no PC do microscópio ou em um PC auxiliar que consiga acessar o microscópio. Ela usa a interface do próprio fabricante do microscópio. Ela oferece ao Samurai uma conexão que funciona da mesma forma para todas as marcas. Você escolhe o microscópio na bridge, não no Samurai.

Microscópios compatíveis com a bridge

Para conectar a bridge ao microscópio:

1. Primeiro, inicie o software do próprio microscópio, por exemplo o TESCAN Essence, o Zeiss SmartSEM ou a interface xT UI da Thermo Fisher.
2. Inicie a Universal SEM Bridge.
3. Escolha o seu microscópio na lista suspensa SEM. Informe o endereço dele e, se for solicitada, a porta.
4. Clique em Connect. Quando o botão ficar verde e mostrar Connected, a bridge está pronta.
5. Deixe a bridge em execução enquanto usa o Samurai.

A faixa de status da bridge tem uma linha Samurai3 connect to: … com o endereço e a porta a serem digitados no Samurai. Assim que o Samurai se conecta, a faixa mostra Samurai3: Connected.

7.2 Conecte o Samurai à bridge

1. No rodapé do Samurai, clique na engrenagem ao lado do indicador SEM. A janela SEM Connection Settings se abre.
2. Informe o IP Address e a Port da bridge. Se a bridge estiver no mesmo PC, use 127.0.0.1. Se não estiver, use o endereço mostrado na linha Samurai3 connect to da bridge. A porta padrão é 15300.
3. Observe a linha abaixo dos campos. Um ✓ verde com Bridge detected; SEM connected. significa que está tudo pronto.
4. Clique em Save.

Em até um segundo, o Samurai se conecta sozinho. O indicador SEM fica verde e mostra o nome do microscópio. Não existe botão Connect para o SEM no Samurai. O Samurai se conecta sempre que a bridge informa que o microscópio dela está conectado. Para desconectar o microscópio, desconecte-o na bridge.

Se a linha abaixo dos campos mostrar um ✗ vermelho, leia a mensagem:

7.3 Conecte o micrótomo

Se Auto-connect Microtome estiver ativado (o padrão), o Samurai se conecta ao controlador ao iniciar. Para conectar manualmente, clique no indicador vermelho Disconnected no rodapé.

Settings › Microtome › Connection define como o Samurai acessa o controlador:

• USB (normal): o Samurai verifica as portas seriais e encontra o controlador sozinho.
• TCP: o Samurai se conecta a um endereço de rede. Use essa opção para o simulador do micrótomo e informe o IP Address e a Port dele.

A alteração passa a valer na próxima conexão.

Para desconectar, clique no indicador verde Microtome. Ele fica laranja e pergunta Disconnect? Clique em ✓ para confirmar. Para cancelar, clique em ✗ ou pressione Esc.

Se a conexão USB cair inesperadamente, uma notificação USB Disconnected permanece na tela com um botão Reconnect. O Samurai nunca reconecta sozinho um micrótomo USB. Verifique o cabo e depois clique em Reconnect ou no indicador.

7.4 Como ler os indicadores

Um indicador verde prova apenas que o Samurai está se comunicando com o equipamento. Ele não prova que o feixe está ligado, que o detector está pronto, que o foco está correto nem que a câmara está livre. Verifique isso no microscópio.

7.5 Equipamentos opcionais

Um engenheiro de serviço ativa os módulos opcionais em Settings › Service › Enabled Modules. Os módulos são Studio, PCN, Kensho BSED e EDS (Oxford AZtec). Depois que um módulo é ativado:

• O PCN se conecta pelo indicador dele no rodapé. As configurações de conexão dele ficam em Settings › PCN (capítulo 20, “A agulha PCN”).
• O Kensho e o EDS se conectam pelos seus próprios painéis na aba Imaging (seção 19.3, capítulo 22, “Mapas de EDS com o Oxford AZtec”).

7.6 Generic SEM: microscópios sem interface

Se o seu microscópio não tiver uma interface de controle compatível, escolha Generic SEM na bridge. A bridge passa então a funcionar como um assistente paciente sentado diante do PC do microscópio:

1. No cartão AutoClicker da bridge, grave o ponto da tela onde fica o botão acquire do software do microscópio. Depois, escolha como a bridge sabe que a imagem terminou:
   • new file appears (um novo arquivo aparece) na pasta de imagens
   • um delay after click (espera fixa após o clique) terminou
   • screen box settles (uma área escolhida da tela para de mudar)
2. Defina a Image folder da bridge como a pasta onde o software do microscópio salva as imagens. Use Test Capture para verificar.
3. No Samurai, o indicador SEM fica verde, como acontece com qualquer microscópio.

A cada ciclo, a bridge clica, espera e envia a nova imagem ao Samurai. O Samurai continua com o controle total do micrótomo e do corte. Mas ele não pode mover a platina do SEM, ajustar o feixe nem escolher o campo de visão. Nesse modo:

• O Samurai adquire uma imagem por ciclo.
• Você não desenha ROIs.
• O Samurai cria os ciclos quando você pressiona Start.
• Os painéis SEM e Autofocus ficam ocultos.

O painel Scripting continua disponível para quaisquer etapas extras (capítulo 23, “Automação com scripts”).

8Trabalhar na área de visualização

A área de visualização (viewport), no centro da aba Imaging, é um mapa da platina do microscópio. Tudo nela é desenhado na sua posição real na platina. Isso inclui a cruz (crosshair) do SEM, as suas regiões de interesse (ROIs) e os tiles delas, as imagens de pré-visualização, as imagens adquiridas e as máscaras. Cada tile é uma posição de imagem dentro de uma ROI. A área de visualização do Studio funciona da mesma forma, então o que você aprende aqui também vale lá.

8.1 A barra de ferramentas

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1. Select (V) — seleciona e move objetos.
2. Hand (H) — desloca a vista. Nunca seleciona nem move nada.
3. Draw ROI (D) — arraste um retângulo para criar uma região de interesse.
4. Cycle through views (0) — mostra cada ROI por vez, depois todas as ROIs e, por fim, a posição do SEM.
5. Follow stage — mantém a posição da platina do SEM no centro.
6. Histogram — mostra ou oculta os níveis de exibição (seção 16.1).
7. Open a read-only viewport window — uma segunda vista para outro monitor.

Mais dois botões aparecem só quando fazem sentido. Draw mask shape (desenhar forma da máscara) aparece enquanto uma máscara desenhada está selecionada (seção 21.3). Um seletor follow target (alvo a seguir) aparece enquanto Follow stage está ativado.

Você só pode usar Draw ROI quando há um experimento aberto e o microscópio dele está conectado. Se um botão estiver acinzentado, passe o ponteiro sobre ele para ver o motivo. Você pode ver Connect SEM first, Create an experiment first ou Connected SEM does not match experiment.

8.2 Deslocamento e zoom

O Samurai funciona como o Figma e outras ferramentas de design: a rolagem move a vista, e o zoom exige um gesto de pinça ou uma tecla modificadora.

A vista para assim que os seus dedos param. Ela não continua deslizando. O zoom fica centrado no ponteiro. Enquanto Follow stage está ativado, o zoom é feito em torno do centro.

A barra de informações

A linha no canto superior direito descreve o que você está vendo:

Grid: 10μm │ FOV: 132.3μm × 114.7μm │ Center: 1.839, 0.209 mm │ Cursor: …

• Grid — o espaçamento das linhas de grade mais visíveis.
• FOV — a largura e a altura da área visível.
• Center — a posição da platina no centro da área de visualização.
• Cursor — a posição da platina sob o ponteiro, quando o ponteiro está dentro dos limites da platina.

Se o experimento tiver uma correção XY (seção 19.1), aparece em seguida um valor (SEM: …) mais apagado. É a posição corrigida para a qual a platina do microscópio realmente se move.

Seguir a platina

Clique em Follow stage para manter a posição da platina do SEM no centro da área de visualização enquanto o microscópio se move. O seu zoom não muda. Enquanto ele está ativado, um segundo botão escolhe o que seguir:

• a stage crosshair (cruz da platina, o padrão), ou
• a last acquired image (última imagem adquirida). Ela mostra onde cada imagem realmente foi parar.

O acompanhamento é desativado quando você desloca a vista manualmente, pressiona 0 ou salta para uma vista salva. Para a vista deslizar em vez de saltar, ative Settings › Advanced › Viewport Tracking Smoothing.

O Samurai lembra a vista de cada experimento. Ele restaura essa vista quando você reabre o experimento.

8.3 Selecionar objetos

Com a ferramenta Select:

A direção em que você arrasta o retângulo faz diferença:

Um retângulo, laço ou polígono seleciona tiles de uma única ROI. Se um retângulo cobrir quase toda uma ROI, o Samurai seleciona a própria ROI. Para adicionar à seleção, mantenha Ctrl/⌘ pressionada ao soltar. Para remover da seleção, mantenha Alt pressionada.

O painel de ROIs mostra a mesma seleção. Quando você não está digitando em um campo de texto, as teclas de seta percorrem a lista de ROIs:

• ↑ ↓ sobem e descem na lista.
• → expande uma ROI para mostrar os tiles dela.
• ← recolhe a ROI.

8.4 Mover e redimensionar

Para mover algo, primeiro selecione, depois arraste. O clique que seleciona um objeto nunca o move.

1. Clique na ROI, ou clique duas vezes em um dos tiles dela, para selecionar a ROI. O contorno dela fica azul.
2. Pressione o botão sobre a ROI selecionada e arraste. O movimento só começa depois que o ponteiro se desloca alguns pixels. Assim, um clique simples continua selecionando um tile.
3. Enquanto arrasta, você pode manter pressionada:
   • Shift para mover apenas ao longo de X ou apenas ao longo de Y. Um indicador ↔ ou ↕ aparece ao lado do ponteiro.
   • T para ajustar o movimento a passos de tiles inteiros.
   • G para encaixar o canto nas linhas de grade visíveis. Uma dica acima da barra de ferramentas lembra essas teclas.
4. Solte para terminar ou pressione Esc para cancelar.

O Samurai registra cada movimento no histórico de desfazer. Assim, você pode desfazê-lo com Ctrl/⌘+Z. Depois que existem ciclos, um movimento vale do ciclo atual em diante. O ciclo atual é o ciclo em que a aquisição está, ou pelo qual ela vai começar. Isso vale seja qual for o ciclo que você está vendo, porque a posição de uma ROI é física (seção 14.3). Você não pode mover uma ROI bloqueada (seção 13.1).

Redimensionamento. Uma ROI selecionada tem uma alça azul no canto inferior direito. Depois que existem ciclos, ela também tem uma alça violeta no canto superior esquerdo. Arraste uma alça para adicionar ou remover linhas e colunas inteiras de tiles. Os tiles que você já tem mantêm os nomes e as posições. A seção 13.5 explica por quê.

Máscaras e referências se movem da mesma forma: selecione e depois arraste. O arraste delas começa imediatamente, sem encaixe. Você pode selecionar uma máscara ou referência bloqueada, mas não pode arrastá-la (capítulo 21, “Máscaras e gating de tiles”).

8.5 Selection Scope para objetos sobrepostos

Quando ROIs, máscaras e referências se sobrepõem, pode ser difícil clicar no objeto que você quer. O Selection Scope (escopo de seleção) limita a área de visualização a um único objeto por algum tempo.

1. Com a ferramenta Select ou Hand, aponte para a área de visualização e pressione ' (apóstrofo). Ou clique com o botão direito e escolha Selection Scope.
2. Escolha uma ROI, uma máscara desenhada, uma referência 2D ou uma referência 3D. Clique nela, pressione o número dela, de 1 a 9, ou use as teclas de seta e Enter.
3. Um pequeno rótulo Scope: aparece no topo da área de visualização. Todo o resto fica esmaecido, e você não pode clicar nele.
4. Para limpar o escopo, pressione ' novamente, pressione Esc ou clique no × do rótulo.

Um escopo é temporário. Ele se limpa sozinho se você mudar para Draw ROI, ocultar o objeto ou abrir outro experimento. Ele não tem nenhuma relação com as Gating ROIs salvas de uma máscara.

8.6 Menus do botão direito

Clique com o botão direito na área de visualização para abrir um menu. Os itens dele dependem do que está sob o ponteiro.

• Drive SEM Stage Here move a platina do microscópio até o centro do tile, ou até o ponto exato em que você clicou. Na primeira vez em que um movimento for maior que 1 mm, aparece um Large Movement Warning (aviso de movimento grande). Ele mostra para onde a platina vai e pede que você clique em Continue.
• Reveal in Explorer abre a pasta que contém os arquivos do tile.
• Re-acquire in This Cycle recoloca o tile na fila do ciclo que está sendo adquirido (seção 15.9).
• Drive PCN here aparece quando a agulha de gás PCN está sendo exibida (seção 20.5).

8.7 O que as cores significam

Outras coisas que você pode ver:

• Nomes das ROIs em roxo acima de cada ROI. O nome inclui o tamanho da grade de tiles da ROI, por exemplo ROI_1 57 × 30 μm. O nome da ROI selecionada fica azul.
• A cruz do SEM marca a posição da platina. Ela pulsa quando você centraliza a vista nela. O ponto dela fica laranja enquanto a platina está se movendo.
• SEM LIVE SCAN — uma moldura azul-clara com uma faixa em movimento. Ela mostra onde o microscópio está fazendo uma varredura ao vivo. É uma varredura iniciada no software do microscópio, não no Samurai.
• Stage Limits — um retângulo vermelho tracejado no limite do curso da platina.
• Pré-visualizações com metade da intensidade. As pré-visualizações do SEM e as capturas manuais de tiles são desenhadas com 50 % de opacidade até que você as selecione. Assim, elas nunca escondem os dados adquiridos (seção 11.2).
• Uma moldura sépia em volta de toda a área de visualização quando você olha um ciclo passado. Uma moldura roxa quando você olha um ciclo futuro (seção 14.2).
• Loading imagery… com um padrão hachurado enquanto o Samurai lê as imagens do disco. Os tiles que nunca foram adquiridos ficam vazios.

8.8 Overlays e vistas salvas

A lista Overlays (camadas exibidas), no canto superior direito, define o que a área de visualização mostra. O Samurai salva as suas escolhas com o experimento.

Views, abaixo de Overlays, guarda o deslocamento e o zoom atuais como um favorito. Digite um nome e clique em Save. Se você salvar com o mesmo nome, a vista anterior é sobrescrita. Clique em um nome salvo para voltar a essa vista. Clique em ✕ para excluí-la. As vistas são armazenadas com o experimento.

8.9 Uma segunda janela

Clique em Open a read-only viewport window para mostrar a aquisição em uma janela separada. Isso é útil em um segundo monitor ou em uma tela de parede.

A janela mostra as mesmas imagens que a janela principal, com os mesmos níveis de exibição. Ela também mostra o mesmo ciclo, inclusive durante o Time Travel. Ela começa na vista da janela principal. Depois disso, tem a sua própria vista. Desloque a vista e aplique zoom como quiser com os botões próprios dela: Select tile, Pan e Fit all tiles. Você não pode editar nada a partir dela. Ela se fecha quando o Samurai se fecha.

9A aproximação

Antes de adquirir imagens de uma nova amostra, você precisa levar a face do bloco exatamente até a navalha. Essa altura é o plano de corte. Nela, a navalha remove um corte fino e uniforme de toda a superfície. Levar o bloco até lá é a aproximação. Você a faz na aba Approach, com a câmara aberta e a câmera Digital Viewer sobre o micrótomo. Você observa a navalha e o bloco pela câmera.

9.1 A aba Approach

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1. Trilha da navalha — a posição da navalha de diamante e a janela de corte azul.
2. Botões da navalha — Cut, jog para a esquerda, jog para a direita e Retract. Mantenha um botão de jog pressionado para mover a navalha.
3. Stage Position — a altura da amostra em µm. Clique no número para digitar uma nova altura.
4. Escala da platina — o pino de amostra sobe e desce com Z.
5. Botões da platina — subir, Zero (Find Zero), descer e o tamanho do passo.
6. Câmera — a imagem do Digital Viewer, com os botões dela no canto superior direito.
7. Painel de aproximação — status, Start/Stop, ciclos e parâmetros de corte.

Os controles da navalha e da platina ficam acinzentados enquanto o micrótomo está desconectado. O mesmo acontece enquanto a platina está elevada para a aquisição de imagens (Imaging Addition, seção 15.2). Os controles também ficam bloqueados enquanto o micrótomo está ocupado com uma aproximação, um corte, um Find Zero ou uma aquisição de imagens. Passe o ponteiro sobre a barra lateral para ver o motivo.

9.2 Z e Find Zero

A altura da platina, Z, é mostrada em micrômetros sob Stage Position (posição da platina). Um valor maior significa que a amostra está mais alta, ou seja, mais perto da navalha. O curso da platina vai de 0 a 1300 µm.

O Z vem de um encoder relativo. O controlador sabe quanto a platina se moveu desde a última vez que encontrou a sua referência. Ele não sabe onde a platina está em termos absolutos. O Find Zero (encontrar o zero) fornece essa referência.

Para encontrar o zero: verifique se não há nada no caminho da platina. Depois, clique no botão Zero, entre as setas para cima e para baixo. A platina desce até chegar ao batente inferior e não conseguir ir mais longe. Em seguida, ela sobe cerca de 5 µm e chama esse ponto de 0.000. Isso pode levar até um minuto, e você não pode interromper o processo. Depois, o console informa Stage zero found (zero da platina encontrado).

Execute o Find Zero nestes casos:

• O controlador foi desligado ou perdeu a alimentação. O Z passa então a indicar 0, seja qual for a posição real da platina.
• O Samurai informa que o driver do motor foi reiniciado e needs re-homing (precisa de nova referência). O Samurai se recusa a cortar até que você execute o Find Zero.
• Você não tem certeza de onde está a platina.

9.3 Mova a platina

• Clique em ou para subir ou descer a platina um passo. Escolha o passo na lista suspensa ao lado deles: 0.5, 1, 10 ou 100 µm.
• Ou clique no número azul de Stage Position, digite uma altura e pressione Enter. A platina vai até essa altura. Esc cancela.

Use passos grandes somente quando a amostra estiver longe da navalha. À medida que se aproximar, mude para passos de 1 µm ou 0,5 µm. A aba Z Movement do console lista todos os movimentos.

9.4 Mova a navalha

A trilha no topo da barra lateral esquerda mostra a navalha de diamante. A navalha corta da direita para a esquerda. A extremidade direita da trilha é a posição totalmente recolhida (longe da amostra). A extremidade esquerda é a posição totalmente avançada.

Defina a janela de corte

A janela de corte é a faixa azul transparente na trilha da navalha. É ali que a navalha corta. Todo corte atravessa a janela na velocidade de corte e se move rapidamente fora dela. Isso vale para os cortes da aproximação, os cortes manuais e o corte de cada ciclo de aquisição. A janela deve cobrir toda a face do bloco.

1. Clique duas vezes na borda esquerda ou direita da faixa azul. A borda fica azul-brilhante e o ponteiro vira ↔.
2. Arraste a borda até onde você quiser.
3. Solte. As bordas não podem mais ser arrastadas. Para ajustar outra vez, clique duas vezes novamente.

O Samurai salva a janela automaticamente. As abas Approach e Imaging compartilham a mesma janela. Você não pode alterá-la enquanto uma aproximação está em andamento.

9.5 A câmera

O centro da aba mostra a imagem do Digital Viewer. A câmera fica desligada quando o Samurai inicia. Ela também para sempre que você sai da aba Approach. Para ver a imagem, clique em Start camera.

Role sobre a imagem para aplicar zoom (de 1× a 5×). Arraste para deslocá-la. A exposição e a taxa de quadros ficam em uma janela separada, Viewer Settings. Um engenheiro de serviço pode abri-la em Settings › Service.

Antes do contato

No plano de corte

9.6 Parâmetros de aproximação

O painel à direita executa a aproximação automática.

Clique em um valor azul para digitar um novo, ou clique na seta ao lado dele para escolher uma predefinição. O Samurai salva os valores automaticamente. Você pode alterá-los durante a execução. Cada alteração vale a partir do próximo ciclo.

9.7 O que um ciclo de aproximação faz

1. A navalha se move rapidamente até o início da janela de corte.
2. A platina sobe o valor de Thickness.
3. O oscilador é ligado e a navalha corta atravessando a janela na velocidade de Cut Speed.
4. O oscilador para.
5. A platina desce o valor de Retract Clearance.
6. A navalha volta rapidamente ao início da janela. No último ciclo, ela volta até a posição totalmente recolhida.
7. A platina sobe de volta à altura de corte.

Clique em Start para começar. O Samurai não pede confirmação. O status mostra Running, e Progress conta os ciclos.

Clique em Stop para terminar. O status mostra Stopping... enquanto o ciclo em andamento é concluído: o corte, a descida de recolhimento e o recolhimento completo da navalha. Depois, a execução termina e o status mostra Idle. O Stop nunca interrompe um corte no meio da passada. Cada Start recomeça a contagem a partir do ciclo 1.

Se Start estiver acinzentado, o micrótomo está desconectado, a platina está elevada para a aquisição de imagens ou o micrótomo está ocupado. Se uma aproximação começar e voltar imediatamente para Idle, leia a aba Errors do console. A linha começa com Approach failed:.

9.8 Passo a passo: aproximação de um novo bloco

Aproximação grosseira com a câmara aberta

1. Verifique o rodapé. Microtome deve estar verde, e o indicador do cabo deve mostrar ✓.
2. Coloque o Digital Viewer sobre o micrótomo e clique em Start camera. Ajuste o gama e o ganho até conseguir ver o fio da navalha e a face do bloco.
3. Clique em Retract para que a navalha fique totalmente recuada.
4. Se a platina ainda não tiver referência, clique em Zero para encontrar o zero (seção 9.2).
5. Defina a janela de corte de modo que a faixa azul cubra toda a face do bloco (Defina a janela de corte).
6. Posicione o diamante sobre a amostra. Arraste-o ou mantenha pressionados os botões de jog.
7. Eleve a platina em passos enquanto move a navalha para a frente e para trás sobre o bloco. Observe a sombra ou o reflexo da lâmina na face do bloco.
8. Reduza o passo à medida que se aproximar: 100, depois 10 e depois 1 µm. Continue até que o reflexo esteja prestes a encontrar a lâmina. Nunca deixe a navalha tirar uma fatia grande.

Aproximação fina com ciclos automáticos

1. No painel de aproximação, defina Thickness, uma Cut Speed rápida e Total Cycles. Por exemplo, use uma espessura de 200 nm para uma primeira aproximação rápida e uma velocidade de corte de 5 mm/s.
2. Clique em Start e observe a navalha e o bloco pela câmera.
3. A navalha geralmente corta primeiro um canto. Espere até que ela corte a face do bloco inteira e então clique em Stop.

Após fazer o vácuo

1. Clique em Stop camera e depois retire o Digital Viewer.
2. Remova os detritos da face do bloco com um jato suave de ar seco ou nitrogênio.
3. Feche a câmara e faça o vácuo.
4. Abaixe a platina 2 µm, porque a amostra pode mudar ligeiramente no vácuo. Clique duas vezes em com passo de 1 µm, ou digite a nova altura.
5. Quando o vácuo estiver pronto, execute ciclos de aproximação até ter cortado pelo menos 2 µm. Isso garante que a navalha encontre a superfície novamente. (Material removido = ciclos × espessura.)
6. Termine com alguns cortes lentos, por exemplo a 0,1 mm/s. Isso deixa uma superfície lisa para a aquisição de imagens.
7. Mude para a aba Imaging. O Samurai registra o Z atual como plano de corte.

9.9 Se algo der errado

10Experimentos

Um experimento reúne tudo o que diz respeito a uma aquisição em uma amostra. Isso inclui as regiões de interesse e os tiles delas, os ciclos e as configurações deles, todas as imagens e o progresso até o momento. Você cria e abre experimentos no painel Experiment, no topo da barra lateral esquerda da aba Imaging.

O painel tem três botões: Load experiment from file (carregar experimento de um arquivo), New experiment (novo experimento) e Save as copy (salvar como cópia). Você não pode usá-los enquanto a aquisição de imagens está em andamento.

10.1 Criar um experimento

Primeiro, o microscópio precisa estar conectado. O experimento registra a qual microscópio pertence.

1. Clique em New experiment. Um formulário se abre no painel.
2. Digite um nome em Experiment Name.
3. Clique no botão de pasta (Select save folder) e escolha onde as imagens serão gravadas. Save to: mostra a pasta que você escolheu. O Samurai lembra a sua última escolha.
4. Se houver outro experimento aberto, você pode marcar Copy ROIs from ‹nome do experimento›. O novo experimento então começa com as regiões de interesse daquele experimento (Começar a partir das ROIs de outro experimento).
5. Clique em ✓ Create experiment ou pressione Enter.

O Samurai cria uma nova pasta dentro da pasta escolhida. O nome da pasta é o nome do experimento seguido da data e da hora, por exemplo mouse-cortex-20260925-101500. Depois, o Samurai abre o novo experimento imediatamente. Se o Samurai não conseguir gravar na pasta, ele avisa você antes de criar qualquer coisa.

• O mesmo nome outra vez? Se já existir um experimento com o mesmo nome, o Samurai pergunta antes de criar um segundo (Create Anyway, criar mesmo assim). O Samurai mantém os dois como experimentos separados, mas os nomes iguais podem confundir você mais tarde.
• Unidades de rede. Alguns microscópios gravam as imagens diretamente em uma pasta compartilhada. Para esses, o Samurai lembra que o local de salvamento precisa ser uma unidade de rede que o PC do microscópio consiga acessar.

Começar a partir das ROIs de outro experimento

Copy ROIs from … copia as regiões de interesse e os tiles delas. Isso inclui posições, tamanhos, sobreposição, tempo de permanência (dwell), marcações de foco automático e tiles desativados. As imagens e o histórico não são copiados. As ROIs copiadas começam desbloqueadas, e todos os tiles começam do zero. Antes de usá-las, confira as posições em relação à nova amostra.

10.2 Abrir um experimento

Clique em Load experiment from file. A caixa de diálogo abre na pasta de experimentos do Samurai. Você pode escolher:

• o arquivo de banco de dados do experimento (.db), ou
• o arquivo .samurai3-db dentro da pasta de dados do experimento. Esse pequeno arquivo aponta para o banco de dados. Escolhê-lo costuma ser mais fácil, porque você sabe onde fica a pasta de dados.

Antes de carregar, o Samurai verifica o microscópio. Se o experimento tiver sido criado em um microscópio diferente do que está conectado, o Samurai não o carrega. Ele mostra SEM does not match experiment (o SEM não corresponde ao experimento). Conecte o microscópio correto e tente novamente.

Se o Samurai tiver sido fechado ou tiver travado durante uma aquisição, ela abre com o status Stopped (parada). Uma nota no console indica o último tile concluído. Pressione Start para continuar a partir dali (seção 15.10).

10.3 Salvar uma cópia

Clique em Save as copy para fazer uma cópia do experimento aberto. Faça isso, por exemplo, antes de testar alterações arriscadas ou para entregar um conjunto de dados a outra pessoa.

1. Digite um nome para a cópia e escolha uma pasta. O Samurai sugere ‹nome›_copy.
2. Para copiar também os dados de imagem, marque Include images (if any exist) (incluir as imagens, se houver). Deixe essa opção desmarcada para copiar apenas as configurações, as ROIs e os ciclos.
3. Clique em ✓ Save copy. O original continua aberto. Para passar para a cópia, clique em Open copy na caixa verde.

A cópia é um experimento totalmente independente, com identidade própria.

10.4 O que é salvo, e quando

Tudo é salvo automaticamente. Não existe botão de salvar. O Samurai grava cada alteração no banco de dados do experimento imediatamente e depois a lê de volta. Assim, o que você vê é o que está armazenado. Enquanto o Samurai grava, o ponteiro mostra brevemente um pequeno ícone giratório (seção 6.5).

Salvos com o experimento:

• as ROIs, os tiles e todas as configurações deles, em cada ciclo;
• os ciclos, suas configurações do micrótomo e o progresso;
• as máscaras e as referências, e o gating delas (quais tiles elas pulam);
• a posição da área de visualização (viewport), as camadas exibidas (overlays) e as vistas salvas, além dos níveis do histograma.

Algumas coisas são salvas uma única vez para toda a instalação, nas configurações do Samurai. São elas: os valores da aba Approach, a janela de corte, a caixa de diálogo Settings e as suas configurações de conexão.

10.5 Onde ficam os arquivos

Um experimento tem duas partes no disco:

• O banco de dados (.db) fica no disco local do PC do Samurai, na pasta de experimentos do Samurai. No Windows, essa pasta é %LOCALAPPDATA%\Samurai3\experiments. Mantê-lo no disco local o protege caso uma unidade de rede se desconecte.
• A pasta de dados é a que você escolheu. Ela contém as imagens e tudo o que é produzido durante a aquisição. As imagens adquiridas ficam em acquisition.zarr. Há um repositório de imagens por ROI, que guarda todas as imagens dessa ROI (capítulo 33, “Dados e arquivos”).

10.6 Trocar de experimento

Quando você abre ou cria outro experimento, o Samurai faz três coisas:

• Apaga o histórico de desfazer, porque esse histórico pertence ao experimento que você deixou.
• Coloca o PCN no modo Off e deixa a agulha de gás onde está (seção 20.3).
• Desliga todas as sequências de script que estiverem ativas. Assim, a automação configurada para um experimento não é executada no seguinte. As sequências em si são mantidas. Se o experimento que você abre tiver sequências próprias, ele as restaura.

Você não pode abrir nem criar um experimento enquanto a aquisição de imagens está em andamento.

11Parâmetros de imageamento e pré-visualizações

Bons dados de imageamento serial de face de bloco precisam de um equilíbrio entre três fatores que puxam em direções opostas:

• a espessura dos seus cortes
• a quantidade de sinal que cada imagem recebe
• o quanto de dano pelo feixe o bloco consegue suportar

Este capítulo mostra onde fica cada configuração e como fazer imagens de pré-visualização. Ele também ajuda você a escolher bons valores iniciais.

11.1 Quem controla o quê

O Samurai e o microscópio dividem o trabalho:

O painel SEM fica na barra lateral direita da aba Imaging. Ele mostra o que o microscópio informa. Você também o usa para fazer imagens de pré-visualização.

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1. Center viewport to stage position (centralizar a área de visualização na posição da platina).
2. Grab Image (capturar imagem) faz uma imagem no campo de visão atual. Grab Image at 100x faz uma visão geral com pouca ampliação.
3. Leituras do microscópio: X e Y da platina, tensão do feixe, corrente do feixe, campo de visão, distância de trabalho, tamanho do pixel e dose de elétrons. Você não pode alterá-las aqui.
4. Configurações de pré-visualização: o tempo de permanência (ou o tempo de quadro, ou o modo de varredura) e o tamanho da imagem. Elas valem apenas para o botão Grab Image.
5. XY Offset — corrige um desvio da platina (seção 19.1).

Os controles do painel dependem do seu microscópio. Por exemplo:

• Os microscópios Hitachi SU3800/SU3900 usam Frame Time (tempo de quadro) em vez de tempo de permanência.
• O SU7000 acrescenta Line Integration (integração de linhas).
• Os microscópios JEOL oferecem Scan Mode (modo de varredura) em vez de tempo de permanência.

Alguns microscópios aceitam qualquer tamanho de imagem. Outros oferecem uma lista fixa.

11.2 Fazer uma imagem de pré-visualização

Uma pré-visualização geralmente é uma imagem grande e rápida de toda a face do bloco. Você a usa para se orientar e para posicionar as suas regiões de interesse.

1. Ajuste o campo de visão no microscópio. Ou use Grab Image at 100x. Ele primeiro define um campo de visão de 1280 µm, e o microscópio permanece nesse campo depois da captura.
2. No painel SEM, escolha o tempo de permanência e o tamanho da imagem da pré-visualização.
3. Clique em Grab Image. Uma barra de progresso percorre a parte inferior da área de visualização (viewport).
4. A pré-visualização aparece na área de visualização, na sua posição real. O Samurai também a adiciona à lista SEM Previews.

Se Imaging Addition (elevação para imageamento) estiver ativada, o Samurai eleva a platina até a altura de imageamento para a captura. Depois, ele abaixa a platina novamente (seção 15.2). Enquanto uma captura está em andamento, você pode cancelá-la com o ✕ vermelho.

SEM Previews lista as suas capturas de pré-visualização. Clique no cabeçalho para expandir a lista.

• Clique em uma pré-visualização para selecioná-la. O Samurai passa a exibi-la por cima das outras, com intensidade total. Clique nela de novo para desmarcá-la. As pré-visualizações não selecionadas são exibidas com metade da intensidade, para nunca esconderem os seus dados.
• centraliza a área de visualização na pré-visualização. O ícone de olho a oculta ou a mostra.
• Clique em e depois em ✓. O Samurai a exclui permanentemente do disco.

Tiles Previews lista as capturas que você fez com os botões de câmera do painel de ROIs. Uma captura pode ser de um único tile ou de uma ROI inteira (seção 12.6). Clique em uma captura para selecionar os tiles que ela cobre. Isso também mostra a captura com intensidade total. Autofocus Images lista as imagens de referência feitas após cada execução do foco automático do próprio microscópio.

11.3 Tamanho do pixel, campo de visão e tamanho da imagem

Três números descrevem cada imagem. Se você escolher dois deles, o terceiro fica definido:

field of view = image width in pixels × pixel size

Por exemplo, 2048 pixels de 10 nm formam uma imagem de 20,48 µm de largura. Se você dobrar o número de pixels e mantiver o tamanho do pixel, o campo dobra. Se mantiver o campo e dobrar o número de pixels, cada pixel passa a ter metade do tamanho. A seção 12.4 mostra como isso define o tamanho dos seus tiles. Ela também traz uma calculadora.

11.4 Tensão do feixe e a profundidade que você vê

A tensão do feixe determina a que profundidade os elétrons entram no bloco. Por isso, ela também determina quanto do material abaixo da face do bloco aparece em cada imagem. Para amostras biológicas, o típico é 2–4 kV.

A regra prática: quando cortar mais fino, reduza a tensão. Cortes de cerca de 50–100 nm funcionam bem em torno de 3–4 kV. Cortes de 30 nm ou menos geralmente precisam de 1,5–2 kV, para que o feixe permaneça dentro de um único corte.

11.5 Dose, sinal e corte

Cada imagem deixa elétrons no bloco. Se o bloco receber elétrons demais, a resina amolece e deixa de ser cortada de forma limpa. O painel SEM mostra a dose de elétrons em e⁻/nm². Ela indica quantos elétrons cada nanômetro quadrado recebe em uma pré-visualização feita com as configurações atuais:

dose = probe current × dwell time ÷ pixel area

Alguns exemplos desse equilíbrio:

• Com uma dose muito baixa, abaixo de cerca de 1 e⁻/nm², você pode fazer cortes muito finos, como de 15 nm. Mas as imagens ficam ruidosas, e o ruído limita a resolução de qualquer forma.
• Várias imagens por corte, uma relação sinal-ruído muito alta ou pixels muito pequenos podem obrigar você a cortar mais grosso. Por exemplo, pode ser necessário fazer cortes de 100 nm para manter o corte limpo.
• Um detector de elétrons retroespalhados mais sensível fornece o mesmo sinal com uma dose menor. Assim, você pode cortar mais fino.

11.6 Um bom ponto de partida

O SBF-SEM (SEM serial de face de bloco) tem um "ponto ideal" para uma amostra biológica bem corada e incluída em resina. Nessa faixa, é fácil obter bons resultados:

Depois, ajuste:

• Para cortar mais fino, reduza a dose ou a tensão, ou use um detector mais sensível.
• Se precisar de mais sinal ou de pixels menores, corte mais grosso.
• Se o bloco sofrer carregamento (um acúmulo de elétrons que estraga a imagem) ou for danificado, reduza a dose ou a tensão.

11.7 Oscilação da navalha

A navalha oscila (vibra muito rápido) enquanto corta. Isso melhora o corte e pode permitir cortes mais finos. A melhor frequência depende da amostra. Sabe-se que 5, 12 e 37 kHz produzem uma boa oscilação no plano, em que a navalha vibra dentro do seu próprio plano. O Samurai oferece essas frequências como predefinições. O padrão do Samurai é 50 kHz com 50 % de amplitude. Deixe o oscilador ligado em uma predefinição. Altere a frequência ou a amplitude apenas se notar artefatos de corte.

Você configura o oscilador de um experimento em Microtome Settings (configurações do micrótomo), na aba Imaging (seção 15.1). A aba Approach tem as suas próprias configurações do oscilador (seção 9.6).

12Regiões de interesse e tiles

Uma região de interesse (ROI) é uma área da face do bloco da qual você quer obter imagens. O Samurai preenche cada ROI com uma grade de tiles. Cada tile é uma imagem do SEM. Um experimento pode ter várias ROIs, e cada ROI tem seu próprio tamanho de imagem, tamanho do pixel e parâmetros de tempo.

12.1 O painel de ROIs

O painel ROIs, na barra lateral direita, lista as suas ROIs. Abaixo da lista, você vê ROI Settings (configurações da ROI) para a ROI selecionada, ou Tile Settings (configurações dos tiles) para os tiles selecionados.

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1. Linha da ROI — a seta mostra os tiles da ROI. O número é a quantidade de tiles.
2. Drag to reorder acquisition order (arraste para mudar a ordem de aquisição).
3. Center viewport on ROI (centralizar a área de visualização na ROI) e Capture ROI (all tiles) (capturar a ROI, todos os tiles).
4. Olho — mostra ou oculta a ROI na área de visualização (viewport). As imagens de uma ROI oculta continuam sendo adquiridas.
5. — desativa ou ativa todos os tiles da ROI.
6. — o bloqueio da ROI (seção 13.1). — exclui a ROI.
7. Linhas de tiles — captura, AF (foco automático), marcador de referência e desativar.

A maioria dos botões das linhas aparece quando você passa o mouse sobre a linha. Clique em uma linha para selecionar a ROI ou o tile. A área de visualização acompanha a sua seleção.

Quando o ponteiro não está em um campo de texto, você pode usar estas teclas:

• ↑ ↓ percorrem a lista.
• → expande uma ROI.
• ← a recolhe.

Na lista de tiles, Ctrl/⌘+clique adiciona tiles à seleção ou os remove dela. Isso funciona até mesmo entre ROIs diferentes.

Depois que os ciclos (rodadas de imageamento e corte) existem, a lista mostra cada ROI precedida do número do ciclo, por exemplo 12-ROI_1. O número indica que a linha pertence ao ciclo que você está visualizando.

12.2 Desenhar uma ROI

1. Verifique se há um experimento aberto e se o microscópio está conectado. Faça uma pré-visualização para ver onde desenhar (seção 11.2).
2. Pressione D ou clique em Draw ROI na barra de ferramentas. O painel mostra New ROI: o tamanho do tile, o tamanho do pixel, o tempo de permanência (dwell) e a sobreposição que a próxima ROI receberá. Altere-os se necessário.
3. Arraste um retângulo sobre a área desejada. Para alinhar o canto e o tamanho à grade visível, mantenha a tecla G pressionada.
4. Solte o botão do mouse. A nova ROI aparece com seus tiles, e o Samurai a seleciona. ROI Settings se abre.

• A ferramenta de desenho continua ativa, então você pode desenhar outra ROI logo em seguida. Para voltar à ferramenta Select, pressione V ou clique em uma linha. Esc muda para a ferramenta Hand.
• Uma ROI menor que um tile é ampliada para um tile inteiro.
• Se uma ROI tiver mais de 1.000 tiles, o Samurai pede que você confirme (Large Tile Count). O Samurai não permite grades com mais de 10.000 tiles.
• As ROIs recebem os nomes ROI_1, ROI_2 e assim por diante.
• Para uma ROI muito grande, um painel Generating tiles... com Cancel aparece brevemente.

Se já existirem ciclos, o Samurai adiciona a nova ROI a todos eles. Nos ciclos anteriores ao atual, ela é criada desativada. Assim, a nova ROI só passa a ser adquirida daqui em diante.

12.3 Configurações da ROI (ROI Settings)

Selecione uma ROI para ver as configurações dela. Para alterar um valor azul, clique nele e digite um novo. Pressione Enter para confirmar ou Esc para cancelar. Ou escolha um novo valor no menu suspenso correspondente.

Se você alterar o tamanho da imagem, o tamanho do pixel, a sobreposição ou o tamanho da ROI, o Samurai reconstrói a grade de tiles. Os tiles desativados e os tempos de permanência definidos por tile são mantidos. O Samurai os associa pelo nome do tile.

Depois que os ciclos existem, uma alteração vale do ciclo atual até o fim da aquisição. Se você estiver visualizando um ciclo futuro, a alteração começa nele (seção 14.3). Você não pode alterar ciclos passados.

12.4 Tamanho do tile, sobreposição e a grade

O tamanho de um tile na amostra é o seu número de pixels multiplicado pelo tamanho do pixel. Os tiles vizinhos ficam a um passo de distância. O passo é o tamanho do tile reduzido pela sobreposição:

• largura do tile = largura em pixels × tamanho do pixel
• passo = largura do tile × (1 − sobreposição)
• tiles na horizontal = o maior número inteiro de tiles que cabe dentro da ROI

A grade começa no canto superior esquerdo da ROI. O Samurai mantém apenas os tiles inteiros que cabem completamente dentro da ROI. Por isso, se a sua ROI for um pouco maior que um número inteiro de tiles, sobra uma estreita faixa sem imagem ao longo da borda direita ou inferior. Isso é intencional: a sua ROI mantém o tamanho que você desenhou. Se precisar dessa faixa, deixe a ROI um pouco maior ou altere a sobreposição.

Os tiles recebem o nome da letra da coluna e do número da linha. A linha superior é A1, B1, C1 …; depois, a linha seguinte começa em A2 …, e assim por diante. Em grades largas, as letras das colunas continuam com Z, AA, AB …. Dentro de uma ROI, o Samurai adquire os tiles nessa ordem, linha por linha.

12.5 Trabalhar com tiles

Ativar e desativar tiles

Desative os tiles de que você não precisa, como resina vazia ou áreas danificadas. Isso economiza tempo e dose do feixe. A aquisição, as capturas de ROI e o EDS pulam os tiles desativados. Um tile desativado é desenhado com um contorno laranja tracejado.

Depois que os ciclos existem, a alteração vale do ciclo atual em diante. Se você estiver visualizando um ciclo futuro, ela vale a partir desse ciclo. Por exemplo, você pode desativar uma área danificada a partir do ciclo 50 e ativá-la de novo a partir do ciclo 60 (seção 14.3). Você pode desativar e ativar tiles durante uma aquisição e também em uma ROI bloqueada.

Configurações dos tiles (Tile Settings)

Selecione um ou mais tiles para ver Tile Settings:

• Dwell Time ou Frame Time — um tempo de permanência só para os tiles selecionados. Ele é usado no lugar do valor da ROI até que você altere novamente o tempo de permanência da ROI.
• Para um único tile: Pixel size, Electron dose (dose de elétrons), Size e Imaging time. A dose só aparece em microscópios que informam a corrente do feixe.
• Disable Tile / Disable Selected Tiles.
• Auto Focus / Auto Focus Selected — marcam os tiles para o foco automático.

Tiles de foco automático

Para usar um tile no foco automático, clique no chip AF da linha dele ou ative Auto Focus em Tile Settings. O chip fica ciano. Escolha tiles com estruturas nítidas e de alto contraste, e evite resina vazia. Os tiles de foco automático têm contorno ciano na área de visualização. O capítulo 17, “Foco automático e correção automática do astigmatismo” explica os métodos.

Tiles de referência

O marcador de lua/sol em uma linha de tile marca um tile de referência para correções de imagem. Cada clique muda o marcador para o estado seguinte: nenhum → referência escura (dark reference) → referência clara (bright reference) → nenhum.

• A referência escura (lua) é capturada com o feixe interrompido.
• A referência clara (sol) é usada para medir a deriva da imagem.

Use dois tiles diferentes para a referência escura e a clara. A seção 16.4 explica para que elas servem.

12.6 Capturar um tile ou uma ROI agora

Os botões de câmera fazem imagens imediatamente, fora de uma aquisição. Use-os, por exemplo, para verificar o foco e as configurações antes de começar, ou para obter uma única imagem de uma região.

• em uma linha de tile captura esse tile.
• em uma linha de ROI é Capture ROI (all tiles). Ele captura todos os tiles ativados da ROI, em ordem. Se alguns tiles da ROI estiverem selecionados, ele captura apenas esses.

O Samurai leva a platina até cada tile. Se um deslocamento for maior que 10 mm, o Samurai pede que você o confirme antes. Se Imaging Addition estiver ativada, o Samurai eleva a platina para o imageamento. Cada imagem aparece no seu lugar na área de visualização. Enquanto o Samurai trabalha, o botão de câmera se transforma em um ícone giratório e em um ✕ vermelho. Clique no ✕ para cancelar.

As capturas aparecem em Tiles Previews, no painel SEM (seção 11.2). Elas são pré-visualizações e não fazem parte dos dados dos ciclos.

Você não pode usar os botões de câmera:

• durante uma aquisição
• enquanto outra imagem está sendo feita
• enquanto você está visualizando outro ciclo no Time Travel

12.7 Várias ROIs

• A ordem de aquisição segue a lista, de cima para baixo. Para alterá-la, arraste o puxador . Uma linha mostra onde a ROI vai ficar.
• A ordem de desenho na área de visualização é uma escolha à parte. Onde as ROIs se sobrepõem, a seta ao lado de ROIs na lista Overlays decide qual delas é desenhada por cima. Os seus cliques também vão para a ROI que está por cima. A ordem de desenho não altera a ordem de aquisição.
• Configurações diferentes por ROI. Cada ROI tem seus próprios tamanho de imagem, tamanho do pixel, parâmetros de tempo, sobreposição, intervalo de Image Every, tiles de foco automático e tiles desativados. Por exemplo, você pode adquirir uma ROI grande de visão geral a cada 10 ciclos com pixels grandes, e uma ROI pequena e detalhada em todos os ciclos.

12.8 Excluir uma ROI

Passe o mouse sobre a linha da ROI e clique em . Depois, clique no ✓ vermelho para confirmar ou em qualquer outro lugar para cancelar. O Samurai remove a ROI de todos os ciclos. As imagens já salvas no disco são mantidas.

Você não pode excluir uma ROI durante uma aquisição em andamento. Também não pode excluir uma ROI bloqueada ("Unlock this ROI before deleting it"). Para desfazer uma exclusão, pressione Ctrl/⌘+Z. Se você quer apenas deixar de adquirir imagens de uma ROI, desative os tiles dela.

13Bloqueio da geometria das ROIs

Depois que uma ROI tem imagens, a posição e a grade dela não podem mudar por acidente. Se isso acontecesse, as novas imagens deixariam de se alinhar com as antigas. Além disso, ao configurar uma ROI, muitas vezes você quer fixar uma coisa, como uma grade de 3 × 3. O Samurai então calcula o resto. Para essas duas tarefas, o Samurai tem dois tipos de bloqueio.

13.1 O bloqueio da ROI

Para bloquear ou desbloquear uma ROI, clique no cadeado na linha dela. Você também pode usar o chip Locked / Unlocked no topo de ROI Settings. Uma ROI bloqueada mostra um cadeado âmbar.

Você não pode mover, redimensionar nem excluir uma ROI bloqueada. Também não pode alterar o tamanho da imagem, o tamanho do pixel, o modo de varredura, a sobreposição, o tamanho nem a grade dela. Nem mesmo o desfazer pode alterá-la.

Você ainda pode:

• renomeá-la, ocultá-la ou mostrá-la e reordená-la
• desativar tiles e marcar tiles de foco automático e de referência
• alterar o tempo de permanência, o tempo de quadro, a integração de linhas e Image Every
• capturá-la e, é claro, adquirir imagens dela

O Samurai bloqueia ROIs por conta própria em dois momentos:

• Quando você gera os ciclos pela primeira vez (seção 14.1). O Samurai então bloqueia todas as ROIs.
• Quando uma captura manual produz uma imagem da ROI (seção 12.6).

Além disso, o Samurai congela a geometria de todas as ROIs enquanto uma aquisição está em andamento. Isso acontece independentemente do estado do bloqueio da ROI.

13.2 Bloqueios de parâmetros

Você pode bloquear seis configurações:

Os bloqueios são rígidos. Quando você altera uma configuração, as outras configurações desbloqueadas se ajustam para que tudo continue se encaixando. Mas, às vezes, a sua alteração só funcionaria se um bloqueio fosse violado. Nesse caso, o Samurai não altera nada. Um aviso, Change blocked by a lock (alteração impedida por um bloqueio), indica os bloqueios que estão no caminho, e eles piscam em vermelho. O vermelho mais intenso marca o bloqueio que você teria de desbloquear primeiro. Nada é salvo até que a alteração seja possível.

Alvo e valor real. Quando você bloqueia um valor, o Samurai o memoriza como alvo. Alguns microscópios não conseguem fornecer exatamente todos os valores, por exemplo, um microscópio com passos fixos de ampliação. Se o valor fornecido for diferente do seu alvo, a dica de ferramenta do cadeado mostra os dois valores. O cadeado passa então a ter três estados:

1. Bloqueado no seu alvo.
2. Um clique: bloqueia novamente no valor que o microscópio fornece.
3. Mais um clique: desbloqueado.

Se você digitar um novo valor em um campo bloqueado, o alvo do bloqueio passa para o novo valor.

13.3 Qual configuração cede

Quando você altera uma configuração, várias configurações desbloqueadas podem conseguir se ajustar a ela. O Samurai então usa uma lista de prioridades para decidir qual delas muda: Settings › Advanced › ROI Lock Priority.

• O item de baixo cede primeiro.
• O item do topo é preservado por mais tempo.
• Os itens bloqueados nunca mudam.

A ordem padrão, do mais protegido ao primeiro a ceder:

1. Tile count (número de tiles)
2. Overlap (sobreposição)
3. Aspect ratio (proporção)
4. Resolution (resolução)
5. Pixel size (tamanho do pixel)
6. ROI size (tamanho da ROI)

Alguns microscópios, como os JEOL, não permitem que o Samurai defina a resolução. Nesses microscópios, Resolution começa no topo. O Samurai memoriza a ordem e os bloqueios para cada microscópio.

Alguns casos típicos:

• Alterar a largura sem nada bloqueado: o campo de visão permanece o mesmo, então o tamanho do pixel muda.
• Com o tamanho do pixel bloqueado: alterar a largura altera, em vez disso, o campo de visão.
• Com a proporção bloqueada: se você alterar a largura ou a altura, a outra também muda, para manter a proporção.
• Com o número de tiles bloqueado: se você alterar a sobreposição, a resolução ou o tamanho do pixel, o Samurai redimensiona a ROI para que os tiles caibam exatamente. O seu tamanho do pixel não é alterado.
• Digitar um novo tamanho de ROI tem prioridade sobre a lista. A ROI assume o tamanho que você digitou. Se o número de tiles estiver bloqueado, ela assume o tamanho mais próximo que se encaixe exatamente.

Os bloqueios de tamanho da ROI, número de tiles, sobreposição e resolução acompanham a ROI selecionada. Quando você seleciona outra ROI, esses bloqueios passam a usar os alvos dessa ROI. Um bloqueio do tamanho do pixel mantém o seu alvo quando você seleciona outra ROI.

13.4 Ajudas para o tamanho do pixel

• As setas ‹ › aparecem ao lado do tamanho do pixel quando apenas certos tamanhos de pixel são possíveis. Isso acontece em microscópios com ampliações fixas, ou quando o tamanho da ROI e a sobreposição estão ambos bloqueados. Cada clique passa para o próximo valor possível.
• Um pequeno indicador após o valor informa o que aconteceu com o valor digitado:
  • snapped: ajustado ao valor mais próximo que o microscópio consegue fornecer.
  • CLAMPED: limitado à extremidade da faixa possível.
  • source: este microscópio não permite que o Samurai defina o campo de visão. O tamanho do pixel apenas registra o que o microscópio fornece.
• Alguns microscópios não permitem que o Samurai defina a resolução. Se o Samurai alterar a resolução em um desses microscópios, uma nota âmbar pede Update the SEM resolution manually (atualize manualmente a resolução do SEM). Defina o novo tamanho no PC do microscópio.

13.5 Aumentar uma ROI sem mover seus tiles

Às vezes, uma estrutura aparece na borda do bloco no meio de uma aquisição. Você quer estender a ROI para incluí-la, sem mexer nos tiles dos quais já adquiriu imagens. Para isso, arraste um canto da ROI.

• Selecione a ROI com a ferramenta Select. Uma alça azul aparece no canto inferior direito dela. Depois que os ciclos existem, uma alça violeta também aparece no canto superior esquerdo.
• Arraste uma alça para adicionar ou remover linhas e colunas inteiras de tiles. O tamanho do tile, o tamanho do pixel e a sobreposição permanecem exatamente como estavam. O mesmo vale para todos os tiles existentes, com seus nomes e posições.
• Você não pode reduzir a ROI além do tile A1.
• As colunas adicionadas à esquerda recebem os nomes XA, XB, …. As linhas adicionadas acima são numeradas 0, −1, …, por exemplo XA-1. Assim, os tiles originais mantêm os seus nomes.
• Você só pode arrastar os cantos, não as bordas.

Se ROI size estiver bloqueado, o Samurai recusa o arraste, e a linha Size pisca. Se Tile count estiver bloqueado, o bloqueio adota o novo número como alvo. Uma ROI bloqueada não mostra alças, então desbloqueie-a primeiro.

14Ciclos e Time Travel

Um ciclo é uma rodada do processo serial de face de bloco. Primeiro, o Samurai adquire imagens da face do bloco: todos os tiles ativados de todas as ROIs. Depois, ele faz um corte para expor a face seguinte. O ciclo 1 adquire imagens da superfície que você preparou durante a aproximação.

Você planeja um experimento como um número de ciclos. Cada ciclo guarda a sua própria cópia das ROIs, dos tiles e das configurações do micrótomo. Assim, você pode planejar mudanças para o futuro e rever o passado.

14.1 Gerar os ciclos

Quando as suas ROIs estiverem prontas, crie os ciclos:

1. Na barra lateral esquerda, clique no número de Total Cycles (total de ciclos). Digite quantos ciclos você quer. Você pode adicionar mais depois.
2. Clique no botão roxo Generate Cycles (gerar ciclos), ao lado dele. A dica de ferramenta dele diz Generate N cycles.

Em seguida, o Samurai:

• cria um ciclo por corte, cada um com as configurações atuais do micrótomo e uma altura Z prevista
• copia todas as ROIs e todos os tiles para todos os ciclos
• bloqueia todas as ROIs, para que a geometria delas não mude por acidente (seção 13.1)
• mostra o controle Time Travel no topo da barra lateral direita
• substitui o botão Generate por Start

Você precisa de pelo menos um tile ativado. Após a geração, você ainda pode alterar Total Cycles:

• Um número maior adiciona ciclos no final, mesmo durante uma aquisição.
• Um número menor remove ciclos do final. Ele nunca remove um ciclo que já começou.

14.2 Time Travel

O Time Travel permite visualizar qualquer ciclo: passado, presente ou futuro. A aquisição em si sempre continua no ciclo atual (o ciclo em que a aquisição está, ou pelo qual ela vai começar). O Time Travel altera apenas o que você vê e o ciclo a partir do qual as suas edições começam.

Enquanto você visualiza outro ciclo:

• O controle fica azul, com PAST, para um ciclo passado. Ele fica roxo, com FUTURE, para um ciclo futuro.
• A área de visualização (viewport) ganha uma moldura sépia (marrom) para um ciclo passado e uma moldura roxa para um ciclo futuro.
• A área de visualização mostra os tiles e as imagens desse ciclo.
• Microtome Settings (configurações do micrótomo) mostra os valores desse ciclo, com (Cycle N) ao lado do título.

Cada passo emite um pequeno som de clique. Para desativá-lo, use Settings › General › Time Travel Click Sound.

14.3 O que muda onde

As alterações nunca reescrevem o passado. Elas valem para a frente, de um ciclo inicial até o fim da aquisição:

Uma alteração temporária exige duas edições. Por exemplo, para pular uma área danificada durante dez ciclos:

1. Vá para o ciclo 50 e desative os tiles sobre a área danificada.
2. Vá para o ciclo 60 e ative-os novamente.

Depois, confira os dois ciclos. Se mais tarde você fizer uma edição que comece antes, digamos no ciclo 40, ela grava de novo para a frente. Ela então substitui as suas duas edições.

14.4 Desfazer e refazer

O Samurai mantém um histórico das suas edições na aba Imaging. Para desfazer, pressione Ctrl/⌘+Z. Para refazer, pressione Ctrl/⌘+Shift+Z ou Ctrl/⌘+Y.

O botão History no canto superior esquerdo da área de visualização mostra onde você está no histórico, por exemplo 7/12. Clique nele para ver a lista, com as entradas mais recentes primeiro. Clique em qualquer entrada para voltar até ela, ou para avançar novamente. Clear history (limpar o histórico) torna o estado atual o novo ponto de partida.

O que é registrado:

• criar, excluir, mover e redimensionar ROIs
• configurações, visibilidade, bloqueio e reordenação das ROIs
• ativar e desativar tiles
• marcações de foco automático e de referência
• dwell por tile
• edições de máscaras e de referências, e quadros-chave

O que não é registrado:

• configurações do micrótomo
• geração de ciclos
• iniciar, parar e pular
• criar ou excluir uma máscara
• sincronizar o gating (Sync)
• configurações de hardware e de aquisição
• deslocamento da vista (pan), zoom e seleção

É bom saber:

• O Samurai executa um desfazer como uma nova edição. Por isso, ele segue as regras que valem agora. Por exemplo, desfazer a movimentação de uma ROI move a ROI novamente, a partir do ciclo atual.
• Desfazer e refazer também não podem alterar uma ROI ou máscara bloqueada. O passo falha com uma mensagem como ROI_1 is locked. Unlock it to change it. (a ROI_1 está bloqueada; desbloqueie-a para alterá-la). O histórico permanece onde estava.
• O desfazer não pode reverter a aquisição de imagem de um tile nem um corte já feito.
• Quando você abre outro experimento, o Samurai começa um histórico novo e vazio. O Studio tem o seu próprio histórico.

15Executar uma aquisição

Este capítulo trata dos controles da barra lateral esquerda da aba Imaging. Use-os para configurar o micrótomo para a aquisição e para iniciar, acompanhar, parar e retomar a aquisição.

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1. Status — Running, Stopping…, Stopped ou Completed (em execução, parando, parada ou concluída).
2. Progress (progresso) — o ciclo atual e o total, o Z do plano de corte (ΔZ), o tempo decorrido e o restante, e o botão Stop.
3. Dwell Ease-In e Debris Detection (detecção de detritos).
4. Microtome Settings (configurações do micrótomo) — espessura, velocidade de corte, folga de recolhimento, Imaging Addition e oscilador.
5. Visor de posição — a navalha e a amostra, o Z em tempo real, Sweep e os botões de aproximação rápida.

Enquanto um ciclo está em execução, o quadro Now / Tile / Next (agora / tile / a seguir), abaixo da barra de progresso, mostra o que o Samurai está fazendo e o que vem depois. Clique na seta dele para ver a lista completa de ações.

15.1 Configurações do micrótomo para a aquisição

Microtome Settings reúne as configurações de corte dos ciclos deste experimento. Elas são independentes dos valores da aba Approach.

Você pode alterar a espessura, a velocidade de corte, a folga e o oscilador durante uma aquisição. Os novos valores valem para os ciclos que ainda faltam. Se você alterar a espessura, o Samurai replaneja a altura Z de todos os ciclos restantes. Em seguida, ele mostra o alvo do próximo corte (Next outgoing cut: +… nm). Se você usar o Time Travel para ver um ciclo futuro, o título mostra (Cycle N). A sua alteração então começa nesse ciclo.

Abaixo das configurações, o visor de posição mostra a navalha sobre a janela de corte, o pino da amostra e o Z em tempo real. Os botões dele agem imediatamente:

• Sweep (varredura) faz uma passagem da navalha para a frente e para trás, sem elevar a platina. Use-o para remover detritos da face do bloco.
• Fine, 100nm e 200nm são botões de aproximação rápida. Cada clique acrescenta um ciclo completo de aproximação a uma fila: elevar, cortar, descer, voltar. Fine usa a espessura e a velocidade de corte de Microtome Settings. 100nm corta 100 nm a 1 mm/s. 200nm corta 200 nm a 2 mm/s. O botão mostra quantos ciclos estão esperando (×N). O ✕ vermelho cancela os restantes.

Você não pode usar esses botões durante uma aquisição nem enquanto a platina está elevada.

15.2 Elevação para imageamento (Imaging Addition)

Em alguns microscópios, a melhor altura para o imageamento não é a altura de corte. Imaging Addition eleva a amostra em uma quantidade definida antes do imageamento de cada ciclo. Assim, a face do bloco fica no foco do SEM. Antes do corte, o Samurai abaixa a amostra de volta até o plano de corte, a altura em que a navalha corta.

Para usá-la, ative Imaging Addition e defina a quantidade (1–1300 µm). Focus Position (posição de foco), acima do visor de posição, passa então a mostrar a altura de imageamento. Se a platina for atingir o limite de 1300 µm antes do fim da aquisição, um pequeno ícone ao lado da quantidade avisa você. O ícone também informa quantos ciclos ainda cabem.

Raise Stage to Focus (elevar a platina até o foco) é o botão de seta ao lado da quantidade. Ele eleva a platina até a posição de foco imediatamente, por exemplo, para você focar o microscópio manualmente. Primeiro, a navalha é recolhida. Enquanto a platina está elevada:

• Uma faixa azul pulsante, STAGE RAISED TO FOCUS (platina elevada até o foco), atravessa o topo da área de visualização (viewport).
• A maioria dos controles da barra lateral esquerda fica coberta, e a aba Approach fica bloqueada.
• O botão de seta se torna Lower Stage to Cutting Plane (abaixar a platina até o plano de corte).

Se uma aquisição parou com a platina elevada, você pode retomá-la assim mesmo. A aquisição continua adquirindo imagens na altura elevada e abaixa a platina antes do próximo corte.

15.3 Aumento gradual do dwell (Dwell Ease-In)

Uma superfície recém-cortada é a mais sensível ao feixe. Dwell Ease-In começa com um tempo de permanência (dwell) curto e o aumenta passo a passo (uma rampa) até atingir o dwell completo da ROI. Cycles define em quantos ciclos a rampa acontece (padrão 10). Com 10 ciclos, o dwell passa por 10 %, 20 %, … 100 %.

Se Now ou Next estiver selecionado, o Samurai configura a rampa novamente toda vez que você pressiona Start ou Resume. Quando a rampa terminar, volte para Off, a menos que você queira que ela recomece após cada retomada. O Ease-In só é oferecido em microscópios que usam tempo de permanência.

15.4 Antes de começar

• A aproximação está concluída, e a platina está no plano de corte (não elevada).
• O microscópio está conectado, focado e com o astigmatismo corrigido. O feixe e o detector dele estão prontos.
• As ROIs, os tamanhos de pixel, os tempos de permanência e a sobreposição estão corretos. Os tiles que você não quer estão desativados.
• Os ciclos foram gerados, em número suficiente e com uma espessura sensata.
• O foco automático, a detecção de detritos, o EDS, os scripts e o gating por máscaras estão configurados como você deseja. O gating por máscaras (pular os tiles que uma máscara não cobre) está sincronizado.
• Se você usa a agulha de gás do PCN, o modo e a posição dela estão corretos (capítulo 20, “A agulha PCN”).
• Há espaço livre em disco suficiente para as imagens.

15.5 Iniciar

Clique em Start. A dica de ferramenta do botão diz o que ele vai fazer: Start, Resume ou Continue (new cycles appended). Se o botão estiver desativado, a dica diz por quê. Por exemplo: Generate cycles first, Microtome not connected ou SEM is disconnected. Reconnect the matching SEM to continue.

Antes da primeira imagem, o Samurai verifica se é seguro começar. Você pode ver:

Em seguida, o status mostra Starting.... A aquisição começa no próximo ciclo não concluído, seja qual for o ciclo que o Time Travel está mostrando.

15.6 O que acontece em cada ciclo

1. Elevar a platina até a posição de foco, se Imaging Addition estiver ativada.
2. Foco automático, se estiver previsto (capítulo 17, “Foco automático e correção automática do astigmatismo”).
3. Adquirir todos os tiles ativados: ROI por ROI na ordem da lista, e tile por tile. Após cada tile, o Samurai pode verificar se há detritos nele (capítulo 18, “Detecção de detritos”). Ele também pode ajustar o brilho do detector (seção 19.3) e coletar um mapa de EDS programado (capítulo 22, “Mapas de EDS com o Oxford AZtec”).
4. Repetir, uma vez, os tiles que falharam neste ciclo.
5. Abaixar a platina até o plano de corte e executar os scripts pré-corte.
6. Estacionar a agulha do PCN, se houver uma instalada, e fazer um corte.
7. Executar os scripts pós-corte e iniciar o próximo ciclo.

No primeiro ciclo, os scripts pós-corte também são executados uma vez no início. Assim, os equipamentos controlados por script ficam prontos para a primeira imagem.

15.7 Acompanhar a aquisição

• Progress mostra o ciclo (por exemplo, 12 / 400) e o Z do plano de corte desse ciclo (ΔZ). Ele também mostra os tempos Elapsed (decorrido) e Rem (restante). Antes de uma aquisição, a estimativa de tempo é marcada como rough (aproximada). Ela melhora depois de alguns ciclos medidos.
• Now diz o que está acontecendo, por exemplo, Imaging ROI_1 - B2, Cutting at 102.350 µm ou Autofocus. Tile mostra o progresso nos tiles deste ciclo. Next diz o que vem a seguir.
• Clique na seta para abrir a lista de ações. Ela mostra cada ROI com a sua contagem de tiles (concluídos/total), os tiles com o status de cada um, e o corte.
• Na área de visualização, o tile que está sendo adquirido pulsa em verde. Uma linha ao longo da borda inferior dele mostra a exposição. Uma linha azul mostra que a imagem está sendo armazenada (seção 8.7).
• As abas Warnings e Errors do console reúnem tudo o que merece a sua atenção.

15.8 Parar

Não existe botão de pausa. Você sempre pode retomar depois de uma parada. Você também escolhe até onde a aquisição vai antes de parar.

• Clique com o botão esquerdo em Stop para parar após a imagem atual.
• Clique com o botão direito nele para ver mais opções:

Enquanto a aquisição está parando, o status mostra, por exemplo, Stopping after this ROI.... Você pode antecipar uma parada pendente, por exemplo, de end of this cycle para after this image. Você não pode adiá-la. Se você pressionar Stop enquanto o corte ou os scripts logo antes ou logo depois dele estiverem em execução, essa etapa termina primeiro. Um corte nunca é interrompido. Após uma parada, o status é Stopped. Se Imaging Addition estiver ativada, a platina pode permanecer elevada.

15.9 Pular e adquirir novamente

Na lista de ações, os ícones de pular pulam o trabalho pendente do ciclo atual. Você pode pular todos os tiles do ciclo, todos os tiles de uma ROI ou um único tile. Clique no ícone novamente para desfazer o pulo. Se você pular todos os tiles, a aquisição segue para o corte. Os pulos valem apenas para o ciclo atual, aquele em que a aquisição está. Eles não desativam tiles.

Se um tile do ciclo atual tiver uma imagem parcial ou ruim, você pode adquiri-lo novamente. Clique com o botão direito no tile na área de visualização e escolha Re-acquire in This Cycle (adquirir novamente neste ciclo). O Samurai adquire o tile de novo após o tile em andamento, ou quando você retomar. O Samurai recusa o pedido para um ciclo concluído, um tile desativado ou o tile que está sendo adquirido naquele momento. Ele explica o motivo.

Um tile falha quando, por exemplo, nenhuma imagem chega a tempo, a conexão é perdida ou a platina não chega à posição. O Samurai então tenta o tile de novo conforme Settings › Advanced › SEM Failed Action Retries. Se o tile ainda falhar, o Samurai o faz piscar em vermelho, avisa você e continua. No fim do ciclo, ele tenta mais uma vez os tiles que falharam. Settings › Imaging › Max Sequential Failed Tiles Allowed interrompe a aquisição quando muitos tiles falham em sequência. Por padrão, a primeira falha já interrompe a aquisição. Se Min Standard Deviation estiver ativado, um tile vazio também conta como um tile com falha (seção 16.3).

15.10 Retomar

Após uma parada, clique em Resume. A aquisição continua exatamente de onde parou, no mesmo ciclo e na mesma etapa. Ela adquire novamente os tiles inacabados.

Se o próprio Samurai tiver parado a aquisição, o console informa o motivo (Imaging paused during cycle N: …). Corrija a causa e depois clique em Resume. Motivos comuns:

Se o Samurai tiver sido fechado ou tiver travado durante uma aquisição, o experimento reabre com a aquisição no status Stopped. Uma nota no console indica o último tile concluído. Verifique a posição da platina, e o Stage Position Warning se ele aparecer. Depois, clique em Resume.

15.11 Quando a aquisição termina

O status mostra ✓ Completed N/N cycles. Para continuar cortando e adquirindo imagens, aumente Total Cycles. O botão passa então a ser Continue (new cycles appended) (continuar, com novos ciclos acrescentados). Se Settings › Imaging › Beam Off on Complete estiver ativado, o Samurai desliga o feixe quando a aquisição termina.

16Exibição de imagens e verificações de qualidade

A aparência de uma imagem na tela e o que foi registrado são duas coisas diferentes. Este capítulo trata dos controles de exibição, que nunca alteram os seus dados. Ele também trata das verificações que o Samurai faz em cada imagem durante uma aquisição.

16.1 Níveis de exibição: o histograma

O painel Histogram, no canto inferior esquerdo da área de visualização (viewport), define os pontos de preto e de branco da exibição. Para mostrá-lo ou ocultá-lo, clique em na barra de ferramentas. Para recolhê-lo a uma única linha, clique na seta dele.

• Uma única configuração para toda a área de visualização. Os pontos de preto e de branco valem para todas as imagens adquiridas na tela. Eles também valem para a segunda janela de visualização.
• O que ele mede. O histograma mostra os tiles selecionados ou a ROI selecionada. Se nada estiver selecionado, ele mostra tudo o que está na tela. Para avaliar os níveis, selecione um tile típico. O resultado vale para tudo.
• Arraste as alças para definir manualmente os pontos de preto e de branco. Você também pode arrastar perto de uma linha no gráfico. B e W mostram os valores deles (0–255).
• Auto corta uma pequena parte dos pixels mais escuros e mais claros, que passam a aparecer como preto ou branco puro. Cada clique com o botão esquerdo passa para o passo seguinte: Fit (a faixa exata dos dados), 0.0001 %, 0.001 %, 0.01 %, 0.1 %, 1 %, 2 %, 5 % e, depois, de volta a Full (0–255). O clique com o botão direito volta um passo.
• track (acompanhar) aplica de novo o nível Auto atual sempre que o conteúdo do histograma muda. Isso acontece com um novo ciclo, uma nova seleção ou a chegada de novos tiles. Assim, a exibição acompanha a aquisição.
• O ícone de cópia copia os valores do histograma para a área de transferência.

Os níveis são salvos com o experimento.

16.2 Correção de campo plano para a exibição

Tiles grandes costumam ficar mais escuros, ou com menos contraste, perto das bordas. O Samurai pode uniformizar isso na tela com uma correção de campo plano (flat field). Ela usa duas imagens de correção, chamadas campos: uma para o brilho e outra para o contraste. As imagens armazenadas não mudam.

Com o experimento aberto, configure-a em Settings › Imaging › Image correction:

1. Clique em ⚙ Generate from experiment… para abrir o Flat-Field Wizard (assistente de campo plano). Escolha uma ROI, um intervalo de ciclos e um método para cada campo. Clique em ⚙ Generate fields. Confira a pré-visualização corrigida do tile central e depois clique em Apply to experiment.
2. Ou clique em Load brightness / Load contrast para usar imagens de campo (PNG) feitas em outro lugar.
3. Defina o modo como Flatfield. Cada campo tem um Correction multiplier (multiplicador de correção, 0–200 %). Ele define a intensidade com que esse campo é aplicado.

A mesma escolha Original / Flatfield está na lista Overlays da área de visualização (seção 8.8). Cada experimento tem a sua própria correção.

16.3 Verificações automáticas durante uma aquisição

O Samurai verifica cada imagem que registra:

16.4 Tiles de referência: brilho e deriva

Dois tipos de tile de referência ajudam você a acompanhar mudanças lentas durante uma aquisição longa. Marque-os com o marcador de lua/sol em uma linha de tile (seção 12.5):

• Uma referência escura (lua) é adquirida a cada ciclo com o feixe interrompido. Ela registra o nível de escuro do detector, para que você possa ver as mudanças no deslocamento (offset) do detector.
• Uma referência clara (sol) é adquirida em uma posição fixa a cada ciclo. O Samurai a usa para medir quanto a imagem deriva. Settings › Advanced › Image Drift Warning (1000 nm) define uma distância. Se a deriva for maior, o Samurai avisa você no console. Isso apenas mede. Nada é corrigido automaticamente.

Se você marcar um tipo, marque também o outro, em um tile diferente. O Samurai se recusa a começar com apenas um. Os metadados de cada imagem de referência registram o tipo dela. Para corrigir a deriva e o brilho automaticamente, consulte o capítulo 19, “Correção de deriva e de brilho”.

16.5 Metadados e temperatura

Cada imagem registrada tem um pequeno arquivo de texto (.md) na pasta metadata do experimento. Ele contém tudo o que se sabe sobre a imagem:

• quando ela foi adquirida
• as configurações do microscópio (tensão, corrente, distância de trabalho, campo de visão, dwell)
• a posição da platina e o tamanho do pixel
• o ciclo e o tile
• eventuais avisos

O registro de temperatura adiciona a temperatura ambiente. Ative Settings › Advanced › Temperature Logging. Depois, digite o endereço do serviço do seu registrador de temperatura em Temperature Source URL. O Samurai então registra a temperatura nos metadados de cada imagem. Ele também grava uma linha por ciclo em temperature-log.csv, na pasta do experimento. O Samurai nunca registra uma leitura antiga demais. Comparar a temperatura com o foco e a deriva pode ajudar você a encontrar a causa de mudanças lentas.

17Foco automático e correção automática do astigmatismo

Em uma aquisição que dura dias, o foco deriva. A amostra sofre carregamento, a temperatura muda e a superfície do bloco se desloca lentamente. O foco automático corrige a distância de trabalho (WD) durante a aquisição, e a correção automática do astigmatismo corrige o astigmatismo. Juntos, eles mantêm as últimas imagens tão nítidas quanto as primeiras.

17.1 Escolher um método

O painel Autofocus, na barra lateral direita, define o método. O método vale para todos os experimentos neste PC.

Se o seu microscópio permitir que o Samurai ajuste os estigmadores, você pode ativar Auto Stig para corrigir também o astigmatismo.

17.2 Marcar tiles de foco automático

Os dois métodos trabalham com os tiles que você marca para o foco automático. Para marcar um tile, clique no chip AF da linha dele ou ative Auto Focus em Tile Settings (seção 12.5). Os tiles marcados têm contorno ciano.

Escolha tiles com estruturas nítidas e de alto contraste, como membranas ou limites da resina. Evite tiles compostos principalmente de resina vazia. Uma boa escolha é uma ROI pequena, longe da sua área de interesse, que você usa só para o foco automático. Assim, a dose extra do feixe fica fora dos dados que você quer (seção 12.7).

17.3 Foco automático do microscópio (SEM Built-in)

Defina Every N cycles no painel (padrão 10). Nesses ciclos, antes do imageamento, o Samurai vai até cada tile de foco automático e executa o foco automático do microscópio. A partir do ciclo 5, a correção automática do astigmatismo é executada nos mesmos ciclos. O Samurai registra a distância de trabalho antes e depois.

Se a rotina falhar, o Samurai descarta o resultado e restaura o foco anterior. Ele faz o mesmo se a rotina alterar a WD em mais do que Max Correction (Settings › Imaging › Heuristic Autofocus, 0,002 mm). Após cada foco automático, o Samurai faz uma imagem de referência. Você a encontra em Autofocus Images no painel SEM.

17.4 Foco automático heurístico

O foco automático heurístico não precisa de imagens extras. Em um ciclo, ele adquire imagens com a WD um pouco acima da estimativa atual da melhor WD. No ciclo seguinte, ele adquire um pouco abaixo. Ele compara a nitidez das imagens. Depois, move a WD um pouco na direção do lado mais nítido.

• Uma correção é aplicada a cada 2 ciclos. Se Auto Stig estiver ativado, o padrão leva 6 ciclos: distância de trabalho, depois o estigmador X e depois o estigmador Y.
• Tracking (acompanhamento) decide quais tiles são medidos e corrigidos:

Reset Reference (redefinir a referência) informa ao foco automático heurístico que você acabou de ajustar manualmente o foco e o astigmatismo. Ele adota a WD e os valores atuais dos estigmadores como novo ponto de partida. Ele também apaga o histórico de correções do ciclo atual e dos ciclos futuros. Os ciclos passados são mantidos. Use-o sempre que refocar manualmente durante uma aquisição.

17.5 Acompanhar o funcionamento

Durante uma aquisição, a barra lateral esquerda mostra uma linha Autofocus com o tile que está sendo focado. A linha também tem um ícone de pular: Skip remaining autofocus for this cycle (pular o foco automático restante neste ciclo). Os tiles que estão sendo focados pulsam em ciano.

Para abrir a janela Heuristic Autofocus Metrics, clique em View Metrics no painel Autofocus:

Role a roda do mouse sobre um gráfico para ampliar os valores. Arraste sobre ele para selecionar um intervalo de ciclos. Export CSV salva os dados.

17.6 Ajustar o método heurístico

As configurações do foco automático heurístico ficam em Settings › Imaging › Heuristic Autofocus. Os valores padrão funcionam para a maioria das amostras.

17.7 Solução de problemas do foco automático

18Detecção de detritos

De vez em quando, um corte deixa uma partícula de detrito na face do bloco. O detrito esconde a estrutura que está por baixo dele. Se ele permanecer ali, estraga o mesmo ponto ciclo após ciclo. O recurso Debris detection (detecção de detritos) verifica os tiles de uma ROI à medida que eles são adquiridos. Se encontrar detritos, ele faz uma varredura da navalha sobre o bloco e adquire o tile novamente.

18.1 Ative a detecção

Na barra lateral esquerda da aba Imaging:

1. Ative Debris Detection.
2. Escolha a Detection ROI (ROI de detecção). É a ROI cujos tiles são verificados. De início, o Samurai escolhe a primeira ROI.

Use uma ROI com estrutura nítida e estável. A detecção vale para o ciclo atual e os ciclos futuros dessa ROI.

18.2 Como um tile é verificado

Logo depois que cada tile da ROI de detecção é adquirido, o Samurai o compara com o mesmo tile em até três ciclos anteriores. Primeiro, as imagens são reduzidas de tamanho, suavizadas e alinhadas, para que o ruído e pequenos deslocamentos não sejam levados em conta. Depois, o Samurai mede que fração do tile parece claramente diferente. Se essa fração estiver acima do Threshold (limiar), e o tile for diferente de todas as imagens anteriores com as quais é comparado, o Samurai considera que há detritos. No primeiro ciclo, não há com o que comparar. Essa imagem se torna a referência.

Quando encontra detritos, o Samurai faz o seguinte:

1. Se Imaging Addition estiver ativada, ele abaixa a platina até o plano de corte. Se houver uma agulha de gás do PCN instalada, ele estaciona a agulha.
2. Ele faz uma varredura da navalha sobre o bloco, sem elevar a platina.
3. Ele volta ao tile, adquire-o novamente e compara mais uma vez.

O Samurai repete isso até Max Sweep Retry vezes. Se o tile continuar diferente, On Max Sweeps decide o que acontece:

• Continue registra um aviso e segue em frente.
• Stop interrompe a aquisição para que você possa examinar.

A linha Now mostra o andamento, por exemplo, Debris check: diff=…, Sweeping debris (1/3) e Re-imaging ROI_1 - B2 after sweep.

18.3 Leia os resultados

• Cada tile verificado tem um pequeno indicador com o seu resultado. Ele fica verde quando o tile está limpo, por exemplo, 0.5% < 50%. Ele fica vermelho quando foram detectados detritos, por exemplo, 75.2% > 50%. Os tiles ainda não verificados não têm indicador.
• Se Diff estiver marcado na lista Overlays da área de visualização, a imagem de diferença mais recente é desenhada sobre o tile dela, com uma borda verde ou vermelha. Diff vem marcado por padrão.
• O console registra cada detecção e cada varredura.

18.4 Configurações

As configurações de detecção ficam em Settings › Imaging › Debris Detection:

As alterações se aplicam imediatamente aos tiles da ROI de detecção.

18.5 Ajuste fino

Comece com os valores padrão, execute alguns ciclos e observe os indicadores:

• Alarmes falsos demais (varreduras em tiles limpos): aumente o Threshold.
• Detritos não detectados: diminua o Threshold ou reduza o Kernel Size para captar partículas menores.

Não defina o limiar tão alto que nada seja detectado. Isso tornaria a detecção inútil. Use os indicadores para encontrar um valor que separe os tiles limpos dos sujos.

19Correção de deriva e de brilho

Ao longo de uma aquisição longa, a imagem pode se deslocar lentamente, porque a platina ou a amostra se move um pouco. O brilho do detector também pode mudar. Você pode corrigir a posição manualmente. O Samurai também pode corrigir a posição e o brilho automaticamente, a cada ciclo.

19.1 Corrija manualmente um deslocamento de posição: XY Offset

Se a platina do SEM se deslocou durante um experimento, as imagens dos ciclos posteriores não ficam mais onde as suas ROIs esperam. O XY Offset (deslocamento XY) alinha de novo as coordenadas da platina do microscópio com a área de visualização. Você clica no mesmo detalhe em uma imagem recente e em uma anterior. A diferença se torna um deslocamento, que o Samurai soma a todos os movimentos da platina a partir de então.

1. No painel SEM, clique em Set offset ao lado de XY Offset.
2. Step 1 of 2 — no ciclo atual, clique em um detalhe fácil de reconhecer. O ponteiro mostra Click · P1 present.
3. Step 2 of 2 — use o Time Travel para ir a um ciclo anterior. Clique ali no mesmo detalhe (Click · P2 past).
4. Confira o deslocamento mostrado (ΔX, ΔY). Depois, clique em Apply Offset ou pressione Enter.

Você ainda pode mover a vista e aplicar zoom enquanto escolhe os pontos. Reset points recomeça. Cancel (ou Esc) fecha sem alterações. Se o deslocamento for maior que 1 mm, o Samurai pede que você o confirme. Um deslocamento tão grande geralmente indica um clique errado.

Quando um deslocamento está ativo, o painel mostra Offset active e o Active total (total ativo). Offset history (histórico de deslocamentos) lista cada alteração. Ele também mostra um pequeno gráfico do deslocamento total ao longo do tempo, com as etapas manuais em âmbar e as automáticas em azul. Reset offset zera o deslocamento. Em Settings › Advanced › Experiment XY Offset, você pode digitar um total absoluto. Cada experimento tem o seu próprio deslocamento.

19.2 Correção automática da deriva XY

O Auto XY drift (deriva XY automática) mede, a cada ciclo, o deslocamento de um tile de referência. Depois, ele corrige a platina automaticamente. Abra-o abaixo do bloco XY Offset, no painel SEM.

1. Escolha o Tile a ser medido: uma ROI e um dos seus tiles. Escolha um tile com estrutura nítida e característica, que seja adquirido no início de cada ciclo.
2. Marque Measure. A cada ciclo, o Samurai passa a comparar esse tile com o último quadro aceito e a registrar o deslocamento. Ele ainda não move nada. O status mostra measuring only (apply off).
3. Quando as medições parecerem corretas, marque Apply corrections. O status passa a mostrar measuring + applying each cycle.

Uma correção é aplicada assim que é medida no tile de referência. Assim, o restante daquele ciclo já é adquirido no lugar certo. O Samurai rejeita uma medição se poucos detalhes corresponderem. Ele também a rejeita se a imagem tiver mudado de escala ou de rotação. Isso indica carregamento ou uma mudança de foco, e não um deslocamento da platina. Uma medição rejeitada nunca é substituída por uma estimativa.

Diagnostics mostra os detalhes correspondentes e o movimento aceito, ciclo a ciclo. Os detalhes que concordam ficam em verde. Os detalhes descartados ficam em âmbar. Mantenha hold: anchor pressionado para alternar entre o quadro e a sua referência. Reset reference recomeça a medição a partir do próximo quadro. Use-o depois de alterar manualmente o deslocamento, ou depois de uma grande mudança na amostra.

Cada correção automática é somada ao deslocamento XY do experimento. Ela aparece em azul no histórico de deslocamentos. O log completo é o arquivo auto-xy-log.csv, na pasta do experimento.

19.3 Brilho automático do detector (Kensho)

Com o detector opcional Kensho BSED, o Samurai consegue manter um tile de referência com brilho constante. Ele faz isso ajustando o offset do detector entre um tile e outro. O painel Kensho BSED aparece quando o módulo está habilitado (seção 7.5).

O detector. Conecte-o pelo indicador no cabeçalho do painel. Brightness, Contrast (0–100 %) e Bias (0–15 V) ajustam o detector. Para ajustar um deles, arraste o ícone da linha dele. Ou passe o mouse sobre a linha e gire a roda do mouse. Mantenha Shift pressionada para passos finos, ou Ctrl/⌘ para passos grandes. Insert / Retract e os controles manuais movem o detector.

Auto brightness (brilho automático):

1. Escolha a ROI e o Tile de referência.
2. Informe o Gain (ganho) calibrado. É quanto a média da imagem muda por passo de offset do detector, em níveis de cinza (DN por contagem). Para medi-lo, faça duas capturas com offsets diferentes. Depois, calcule (média₂ − média₁) ÷ (offset₂ − offset₁).
3. Ative Enabled. A próxima captura do tile se torna a referência.

Após cada captura desse tile durante uma aquisição, o Samurai compara o brilho médio dela com a referência. Depois, ele ajusta levemente o offset do detector para compensar a diferença. Ele faz isso com suavidade, em passos limitados, e nunca durante uma exposição. Cada passo corrige só uma parte da diferença (amortecimento). Se a alteração total for ultrapassar o limite, o brilho automático se desliga sozinho. Reset reference faz da próxima captura a nova linha de base. Cada correção é registrada em kensho-brightness-log.csv, na pasta do experimento.

20A agulha PCN

O PCN é uma agulha opcional que sopra um pouco de gás sobre a área que você está imageando. O gás reduz o carregamento (um acúmulo de elétrons que estraga a imagem). Três pequenos motores movem a agulha. O Samurai a posiciona para a aquisição de imagens e, o mais importante, a tira do caminho da navalha antes de cada corte.

20.1 Ative e conecte

Um engenheiro de serviço habilita o PCN em Settings › Service › Enabled Modules › PCN. Você define a conexão em Settings › PCN › Connection. Escolha USB com uma porta (ou Automatic), ou TCP para um simulador. Para conectar quando o Samurai iniciar, ative Auto-connect PCN.

O indicador PCN no rodapé mostra a conexão:

• Verde: o controlador responde.
• Amarelo (Connecting...): o Samurai está se conectando.
• Vermelho (PCN Disconnected): o controlador não responde.

Clique no indicador para conectar. Quando o PCN está conectado, um clique no indicador o desconecta, depois que você confirma. O indicador volta a ficar verde sozinho quando o controlador responde.

20.2 O painel PCN

O painel PCN fica na aba Imaging. De cima para baixo, ele contém:

• Manual needle drive — move a agulha ao longo de K, C e Z (seção 20.5).
• Indicador de posição — mostra onde a agulha está. Clique nele para a próxima ação.
• X Y Z — a posição da ponta da agulha na área de visualização, depois que a agulha é calibrada. O controle direcional (jog pad), ao lado, move a agulha em pequenos passos.
• Mode — Off, Fixed ou Tracking.
• Show needle — desenha a agulha sobre a imagem. Você pode alinhar o desenho à ponta real.
• Gas Discharge Footprint — a área onde o gás incide. Desenhe-a com .

A leitura X/Y/Z usa as mesmas coordenadas da platina do SEM e das suas ROIs. K e C estão girados em relação à área de visualização. Por isso, um movimento apenas ao longo de K, por exemplo até Retracted, altera tanto X quanto Y. Isso é esperado, não é deriva.

O indicador de posição

O indicador mostra onde a agulha está. Clique nele com o botão esquerdo para a ação mais urgente. Clique com o botão direito para ver todos os destinos.

20.3 Os três modos

Mode decide o que a agulha faz enquanto você adquire imagens:

• Escolher um modo nunca move a agulha. A agulha se move quando você escolhe um destino, quando pressiona Start, e antes e depois de cada corte.
• Fixed e Tracking exigem um experimento aberto e uma calibração válida (seção 20.6).
• O modo volta para Off sempre que o Samurai é reiniciado, sempre que você abre outro experimento e após qualquer falha ou Clear. Escolha Fixed ou Tracking novamente quando precisar.
• Se as últimas imagens do experimento foram adquiridas em Fixed ou Tracking, mas o PCN agora está em Off, um âmbar aparece ao lado de Start. É apenas um lembrete.
• Antes de cada tile, o Samurai verifica se a agulha está onde o modo a quer. Em Fixed ou Tracking, a agulha precisa estar em Engaged. Às vezes ela não está, por exemplo quando o intertravamento da navalha (que recolhe a agulha antes de um corte) a deixou estacionada em Retracted. Nesse caso, o tile não é adquirido, e a aquisição é pausada com uma mensagem como The needle is at 'free', not Engaged…. Leve a agulha de volta para Engaged ou coloque o PCN em Off.

20.4 Engaged, Retracted e a elevação em Z

Engaged é a posição de aquisição. No modo Fixed, a linha ENGAGED POSITION a mostra. Para defini-la, leve a agulha até onde você quer com o acionamento manual ou o controle direcional. Depois, clique em Update the Engaged position e confirme com ✓. O Samurai a armazena com o experimento: o K e o C dela, mas não a altura. Em Tracking, Engaged não é um lugar armazenado. Significa que a área de gás está centrada na cruz do SEM.

Retracted é a posição segura, mais recuada ao longo de K. O próprio controlador do PCN a armazena. Só o K dela importa. Antes de defini-la, todos os eixos precisam estar indexados. Leve a agulha até lá e depois use Settings › PCN › Set current position as Retracted position → Apply.

O Z lift per XY move (elevação em Z por movimento XY; Settings › PCN) dá folga à agulha. Antes de cada movimento lateral, a agulha sobe esse valor. Depois, ela se move e volta à altura de onde partiu. Isso vale para os jogs, para Drive PCN here, para o rastreamento e para os movimentos entre Engaged e Retracted. A elevação é a única mudança de altura que o Samurai faz por conta própria. Não há altura de aquisição nem altura de corte armazenadas. O padrão é 0 (sem elevação).

Return to Engaged after retract (Settings › PCN) traz a agulha de volta para Engaged depois de cada corte. Essa opção vem ativada por padrão. Se você a desativar, a agulha permanece em Retracted após um corte. Em Fixed ou Tracking, a aquisição então é pausada no próximo tile.

20.5 Mova a agulha manualmente

Manual needle drive (acionamento manual da agulha). Clique em no cabeçalho do painel. O acionamento move a agulha ao longo dos seus próprios eixos, em milímetros. Ele não precisa de calibração.

• As linhas K (Knife), C (Cross) e Z mostram, cada uma, a posição e têm botões − e +. Escolha o Step (1–500 µm). Cada jog tem no máximo 1 mm. Os jogs em K e C usam a elevação em Z.
• Um eixo que está em um limite fica âmbar. Se um jog atingir um limite, o Samurai encurta o jog e mostra um aviso. Se o último movimento de um eixo não chegou ao destino, esse eixo fica vermelho.
• Para salvar a posição atual com um nome, clique no + tracejado. Para voltar a uma posição salva, clique no nome dela. Se esse ponto for mais alto, a agulha muda de altura primeiro. Se for mais baixo, a agulha muda de altura por último.

Jog pad (controle direcional). Clique em ao lado da leitura X/Y/Z para abrir o controle direcional. Ele move a ponta nas direções da tela (para cima, para baixo, para a esquerda, para a direita) em passos de 5–500 µm. Z+ e Z− mudam a altura. Os movimentos nas direções da tela exigem calibração.

Drive PCN here (levar o PCN até aqui). Com Show needle ativado, clique com o botão direito na imagem e escolha Drive PCN here. O centro da área de gás se move até esse ponto.

Um jog lateral deixa a agulha em Free, e o rastreamento é pausado. Um movimento que muda apenas a altura mantém Engaged ou Retracted. Para parar uma agulha em movimento, pressione Esc a qualquer momento.

20.6 Calibre a agulha em relação à imagem

A calibração mede como os eixos K e C da agulha estão girados em relação à imagem do SEM. Ela também encontra onde estão a ponta e a haste. Você precisa dela para Fixed e Tracking, para o controle direcional, para Drive PCN here e para o desenho da agulha.

Abra Settings › PCN › Calibration Wizard ou clique em Calibrate no painel. Antes de começar, verifique se:

• o SEM está conectado e ocioso;
• o SEM está com a rotação de varredura em 0°;
• a ponta da agulha e parte da haste estão visíveis.

O Samurai define um campo de visão de 1 mm para a calibração e depois restaura o seu. Se o Samurai não conseguir definir esse valor no seu microscópio, defina você mesmo 900–1000 µm. Não mova a platina do SEM depois que a primeira imagem for aceita.

1. Prepare — leia a lista de verificação e clique em Next. A agulha vai se mover, mas somente dentro de 200 µm de onde está agora.
2. Origin & shaft — clique na ponta (tip) da agulha e depois em um ponto mais adiante na haste (shaft). Você pode arrastar qualquer um dos marcadores para refiná-lo, usando as vistas ampliadas 4×. Next move a agulha 200 µm ao longo de K e adquire uma imagem.
3. K axis — o Samurai procura a ponta. Confira o marcador da ponta, ou clique nele e arraste-o. Depois, clique em Next. A agulha se move ao longo de C.
4. C axis — faça o mesmo para o segundo movimento.
5. Verify — um movimento diagonal de 100 µm verifica o resultado de forma independente. Em seguida, a agulha volta ao seu ponto de partida.
6. Result — mostra o ângulo, a orientação dos eixos (normal ou espelhada) e o erro de verificação. Apply calibration salva a calibração. Se o erro estiver acima do limite de 5 µm, você ainda pode clicar em Accept anyway. O Samurai registra essa aceitação forçada.

O assistente nunca avança sozinho. Você pressiona Next em cada etapa. Cancel devolve a agulha para onde ela começou. Depois que os eixos recebem uma nova referência (veja Indexação dos eixos), normalmente é preciso calibrar de novo.

20.7 Mostre a agulha e desenhe a área de gás

Ative Show needle para desenhar a agulha sobre a imagem, na sua posição em tempo real. Se o desenho não ficar exatamente sobre a ponta real, clique no ícone de âncora. Depois, clique onde a ponta realmente está. Isso move o desenho, não a agulha.

Gas Discharge Footprint (área de descarga do gás) é o círculo onde o gás incide. O Samurai a usa para mirar a agulha (Tracking e Drive PCN here). Até você desenhá-la, o Samurai usa um círculo padrão de 300 µm um pouco à frente da ponta. Para desenhar a área real, Show needle precisa estar ativado e a agulha precisa estar calibrada. Depois:

1. Clique em ao lado de Gas Discharge Footprint.
2. Clique no centro da área de gás na imagem.
3. Clique na borda dela para definir o tamanho. O Samurai mostra Gas footprint saved ✓.

A área de gás se move junto com a ponta. Se você redesenhá-la durante o Tracking, o Samurai centraliza a agulha novamente. Ele faz isso imediatamente, ou antes do próximo tile se uma imagem estiver sendo adquirida.

20.8 Proteção da navalha

Com o módulo PCN ativado, a navalha e a agulha ficam intertravadas. Isso significa:

• Antes de cada corte, a agulha é recolhida ao longo de K até Retracted, com a elevação em Z. Isso vale para as aquisições, os cortes manuais, as varreduras e as aproximações. Também vale sempre que a navalha entra na faixa de corte.
• Depois do corte, a agulha volta para Engaged se o modo e Return to Engaged after retract assim determinarem.
• Em Start/Resume com o modo Off, a agulha é levada primeiro para Retracted. Se isso falhar, a aquisição não começa.
• Durante cada exposição, o Samurai monitora a agulha. A agulha pode se mover ou relatar uma falha enquanto um tile é varrido. Se isso acontecer, o Samurai indica o tile no log (…check this tile for a needle smear… — verifique se há uma mancha da agulha neste tile). A imagem é mantida e a aquisição continua.
• Os movimentos da agulha que falham são repetidos. O número de tentativas é definido em Settings › Advanced › PCN Failed Action Retries (padrão: 3).
• Se o PCN estiver desconectado, o corte só é permitido se a última posição conhecida da agulha for Retracted.

Disable knife protection (Settings › PCN) desativa tudo isso. Essa opção serve para sessões em que a agulha foi fisicamente removida. O Samurai pede confirmação. Enquanto a opção estiver ativa, o painel mostra uma faixa âmbar. O Samurai mantém a configuração após uma reinicialização. Desative-a novamente antes de reinstalar uma agulha.

20.9 Indexação dos eixos

Depois que o controlador é ligado, ou quando ele perde a sua referência, o indicador mostra Un-indexed. A agulha não se move. A indexação move cada eixo ao longo do seu curso para encontrar o ponto de referência dele.

Clique no indicador (Index) ou use Settings › PCN › Index PCN. Confirme com Needle removed - start e aguarde. Depois, K se move para a posição Retracted. Se nenhuma posição Retracted estiver armazenada, K se move até o seu limite de curso. C e Z não mudam.

20.10 Falhas e solução de problemas

Quando algo dá errado, o indicador fica vermelho e o modo cai para Off. Nada se move até que a falha seja eliminada. Verifique a agulha e depois clique no indicador (Clear / Accept). O Samurai lê a posição novamente e verifica se a agulha está parada. Ele não move a agulha.

20.11 Para engenheiros de serviço: a janela PCN Service

O controlador do PCN guarda na sua própria memória a sintonia dos motores, a política de movimento, o registro de referência e os limites. O Samurai os lê quando se conecta. Ele nunca os altera por conta própria. O trabalho de serviço é feito em uma janela separada. Para abri-la, desbloqueie Settings › Service e depois clique em Open PCN service panel.

• Clique em Open service session (abrir sessão de serviço) antes de alterar qualquer coisa. Uma sessão dura 30 minutos, e a janela a renova para você. Ao terminar, pressione Close session. Fechar apenas a janela não encerra a sessão. Encerrar uma sessão restaura os padrões seguros da placa. Os limites de curso por software (soft limits) voltam a ficar ativos. A telemetria (o fluxo de dados de status da placa) e a velocidade voltam aos valores da sintonia.
• STOP, no topo, funciona sempre que o PCN está conectado.
• As abas são Status, Tuning, Motion policy, Limits & referencing, Relays & power, Motion, Diagnostics, Bench tests e Terminal.
• Limits & referencing oferece três métodos: Find index, Find index + limits (sets zero) e Find limits (sets zero). O do meio é o método normal. Cada método pede que você confirme que a agulha foi removida. Depois de uma busca de limites, armazene novamente a Retracted position. A aba também contém User limits, Logical moves, Go to zero e Last known position. Esta última pode restaurar a referência sem indexação, então nada se move. Ela só faz isso quando todas as verificações comprovam que a platina não se moveu desde que a posição foi registrada.
• Motion registra a telemetria da placa e desenha cada movimento ao longo do tempo e em 3D. Ela não registra nada até você ativá-la.
• As alterações de sintonia e de política só são gravadas quando você pressiona Store. Antes, a janela mostra os valores exatos. Os testes de bancada nunca gravam na memória da placa.

21Máscaras e gating de tiles

Uma aquisição longa gasta boa parte do tempo adquirindo tiles que não importam. Alguns mostram apenas a resina ao redor do tecido. Outros ficam fora da estrutura que você acompanha, porque a estrutura se desloca à medida que o bloco é cortado mais fundo. As máscaras descrevem, em três dimensões, onde estão os dados que interessam a você. Em seguida, o Tile gating (gating de tiles) as usa para pular os tiles que ficam fora das máscaras, ciclo a ciclo.

O painel Masks também contém imagens e volumes de referência. Podem ser uma imagem óptica, um volume de raios X (microCT) ou qualquer outro conjunto de dados. Você pode alinhá-los à sua aquisição. Depois, use-os como guia, ou até como máscara.

As máscaras e os volumes de referência são desenhados sobre as imagens adquiridas, mas sob os contornos dos tiles e das ROIs. Uma referência 2D plana é desenhada sob as imagens adquiridas, como um pano de fundo.

21.1 O painel Masks

Quando há um experimento aberto, o painel Masks fica na coluna direita da aba Imaging. O painel abaixo dele, Mask Properties, mostra as configurações do item selecionado.

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1. Import, Draw Mask e Load.
2. O ponto de sincronização pendente, em âmbar. Clique nele para sincronizar o gating de tiles (Sync: aplique a decisão).
3. Uma linha: o nome, o seu indicador e um vermelho quando o Tile gating do item está ativado.
4. Botões que aparecem ao passar o ponteiro: centraliza a vista no item, mostra ou oculta, bloqueia, exclui.

• Clique em uma linha para selecionar o item. Clique nela novamente para desmarcá-lo. Selecionar uma máscara limpa qualquer seleção de ROI ou de tile. Selecionar uma ROI ou um tile limpa a seleção da máscara.
• Delete pede um segundo clique no ✓ vermelho. A exclusão remove a cópia do item na pasta do experimento, nunca um original guardado em outro lugar. Você não pode desfazer uma exclusão. Se o item faz gating de tiles, um aviso explica o que vai acontecer com eles (Libere o gating).
• Um item bloqueado sempre mostra o seu cadeado âmbar, e você não pode excluí-lo (seção 21.8).
• As novas máscaras desenhadas recebem os nomes Mask 1, Mask 2… Os itens importados recebem o nome do arquivo.

21.2 Importe uma imagem ou um volume de referência

Clique em Import e escolha um arquivo. O Samurai identifica que tipo de item ele é:

• Referência 2D plana — qualquer PNG, JPG ou BMP, e qualquer TIFF com uma única página. O Samurai a posiciona no centro da vista, com o lado mais longo medindo 1 mm. Mova-a e ajuste a escala para encaixá-la (veja abaixo). O Samurai faz uma cópia de todo TIFF e de toda imagem com mais de 8192 pixels em um dos lados. A cópia tem no máximo 8192 pixels no lado mais longo, o que mantém o desenho rápido.
• Volume de referência — um TIFF com duas ou mais páginas. Cada página se torna uma profundidade. A primeira página é posicionada na profundidade do ciclo mostrado na tela, e a pilha continua em direção ao fundo. O Samurai lê o tamanho do voxel do volume (o tamanho de um pixel em X, Y e Z) a partir do TIFF, por exemplo de uma calibração do ImageJ/FIJI. Se o TIFF não tiver essa informação, o Samurai estima um tamanho que faz a pilha ocupar cerca de três quartos da vista.

O Samurai copia o arquivo para a pasta overlays do experimento. Assim, o experimento continua completo se o arquivo original for movido. Volumes maiores que cerca de 1,5 GB não são mantidos na memória. O Samurai os lê do disco conforme necessário.

Load () reabre arquivos de overlay salvos por versões mais antigas do Samurai. As máscaras desenhadas não são arquivos. Elas ficam guardadas no próprio experimento.

Quando você abre um experimento, o Samurai restaura as máscaras e as referências dele (Restoring overlays…). Cada linha mostra um ícone de carregamento até que o seu item esteja pronto.

21.3 Desenhe uma máscara

Uma máscara desenhada é formada por quadros-chave (keyframes). Um quadro-chave é um contorno que você traça em um determinado ciclo. Entre dois quadros-chave, a forma muda gradualmente de um para o outro.

1. Use o Time Travel para exibir o ciclo em que você quer desenhar. A forma fica no ciclo que está na tela quando você começa a desenhar.
2. Clique em Draw Mask. Uma nova máscara aparece (no shape yet). O lápis na barra de ferramentas da área de visualização fica âmbar para mostrar que está pronto para desenhar.
3. Clique na área de visualização para posicionar os vértices da forma. Uma linha tracejada rosa acompanha os seus cliques. Backspace remove o último ponto. Você ainda pode deslocar a vista e aplicar zoom.
4. Para fechar a forma, clique perto do primeiro ponto ou pressione Enter. Quando o ponteiro está perto do primeiro ponto, esse ponto fica verde (Click to close). Uma forma precisa de pelo menos três pontos.

A primeira forma transforma a máscara em uma máscara de verdade (Created mask: Mask 1…). O lápis desenha uma forma de cada vez. Para adicionar outra forma, clique novamente em na barra de ferramentas. O lápis aparece sempre que uma máscara desenhada visível e desbloqueada está selecionada. Uma forma desenhada em um ciclo que já tem um quadro-chave é adicionada a ele. Assim, duas formas podem compor uma máscara com duas partes, ou um anel.

Esc cancela a forma que você está desenhando. Se você já tinha posicionado pontos, o Samurai avisa, por exemplo Unfinished shape discarded (3 points) (forma inacabada descartada, 3 pontos). Trocar de ferramenta, selecionar outro item, ou ocultar ou bloquear a máscara também descarta uma forma inacabada. Você pode desenhar antes de existir qualquer ciclo. Nesse caso, o primeiro quadro-chave pertence ao ciclo 1.

Enquanto você traça, a faixa abaixo da área de visualização mostra o número de pontos e as teclas: Enter concluir, Backspace desfazer ponto, Esc cancelar.

Quadros-chave e extrapolação da forma

Desenhe um quadro-chave sempre que a estrutura mudar de forma visível. Alguns quadros-chave bem posicionados costumam bastar. Shape extrapolation (extrapolação da forma), em Mask Properties, decide a forma da máscara nos ciclos fora do intervalo dos seus quadros-chave. Você a define separadamente para duas direções. Forward é depois do último quadro-chave, e Backward é antes do primeiro:

A lista Keyframes, em Mask Properties, tem uma linha por quadro-chave (Cycle 15, Cycle 40…). A linha do ciclo mostrado na tela fica em tom âmbar. Clique em uma linha para selecionar o quadro-chave. O contorno dele fica azul. Passe o ponteiro sobre uma linha para ver dois botões. Jump to cycle exibe esse ciclo e enquadra a forma. Delete this keyframe remove o quadro-chave. Você não pode excluir o último quadro-chave. Nesse caso, exclua a máscara.

A área de visualização desenha apenas os quadros-chave do ciclo exibido. O selecionado fica azul, com os seus pontos de vértice. Os outros ficam rosa.

Edite uma forma. Selecione o quadro-chave e exiba o ciclo dele. Com a ferramenta Select, arraste qualquer um dos seus pontos de vértice. Para devolver o vértice ao lugar, pressione Esc durante o arraste. O Samurai salva a alteração quando você solta o botão do mouse.

21.4 O painel Mask Properties

O que o painel mostra depende do item:

Os campos numéricos funcionam da mesma forma em todo lugar:

• Arraste o ícone do campo ou a letra do eixo (X, Y, Z) para os lados para alterar o valor. Mantenha Shift pressionada para passos dez vezes mais finos.
• Clique no número para digitar um valor. Pressione Enter ou clique fora do campo para aplicá-lo. Esc cancela.
• Clique na etiqueta de unidade à direita de uma linha (por exemplo, µm / mm) para mudar a unidade.
• Passe o ponteiro sobre o rótulo de uma linha para mostrar Reset. Clique nele e depois confirme com ✓. Para um volume de referência, Reset restaura o valor que ele tinha quando foi importado. Para uma máscara desenhada, restaura o posicionamento com que a máscara foi desenhada.
• ao lado de Voxel size (e de Scale) mantém as proporções. Assim, alterar a escala de um eixo altera a de todos. Clique nele para ajustar a escala de cada eixo separadamente.
• Opacity e Bin × são aplicados quando você solta o botão do mouse. Voxel size, Position, Rotation, 3D Cursor e Scale acompanham o seu arraste em tempo real.

21.5 Mova, gire e ajuste a escala

Você posiciona as máscaras e os volumes de referência pelo teclado, como nos softwares 3D, ou arrastando com o mouse. O item precisa estar selecionado, visível e desbloqueado.

Enquanto uma transformação (um movimento, uma rotação ou uma mudança de escala) está em andamento, o ponteiro do mouse fica oculto. Linhas-guia coloridas mostram um eixo restrito: X vermelho, Y verde, Z azul. Os campos em Mask Properties acompanham a alteração. Se o Samurai perder o foco (outra janela ficar ativa), a transformação é cancelada.

O cursor 3D é o alvo laranja em torno do qual Rotate e Scale operam. Para posicioná-lo, mantenha Shift pressionada e arraste com o botão direito do mouse. Para mantê-lo sobre uma linha, pressione X ou Y durante o arraste. Posicione-o sobre um detalhe que interesse a você, para que a rotação e a mudança de escala aconteçam em torno desse detalhe. Posicionar o cursor nunca move o item.

Com o mouse. Com a ferramenta Select, clique em um item para selecioná-lo. Depois, arraste-o para movê-lo em X e Y. Uma referência 2D selecionada tem duas alças de canto. Arraste uma delas para redimensionar a imagem, enquanto o canto oposto fica fixo. A ferramenta Hand apenas desloca a vista.

A faixa abaixo da área de visualização lembra as teclas enquanto uma máscara está selecionada: G move · R rotate · S scale · Shift + right-drag cursor · X/Y/Z axis · Enter confirm · Esc cancel.

Clique com o botão direito em uma máscara para ver Highlight in Outliner, Drive SEM Stage Here, Drive PCN here, Zoom 1:1 e Selection Scope.

21.6 Alinhe um volume de referência

Register (registrar) alinha um volume de referência às suas imagens adquiridas. Ele usa pares de pontos correspondentes. Para cada par, você clica no mesmo detalhe uma vez na imagem do SEM e uma vez no volume.

1. Selecione o volume de referência. Exiba um ciclo em que você reconheça detalhes nos dois.
2. Na seção Register, clique em +.
3. Clique no detalhe na imagem adquirida. A mensagem ao lado do ponteiro passa então a mostrar Now click the matching point on the overlay.
4. Clique no mesmo detalhe no volume. O par aparece como P1. O Samurai agora está pronto para o próximo par. Repita para adicionar mais pares.
5. Para parar de escolher pontos, clique em ✗ ou pressione Esc. Para aplicar o alinhamento, clique em ✓.

Com um par, o volume apenas se desloca. Com dois ou mais, o Samurai também calcula a rotação e a escala dele, como o melhor ajuste para todos os pares. A partir de dois pares, Deformations define como a escala pode mudar:

• Uniform scale: a opção mais segura, e o padrão.
• XY/Z aspect: uma escala no plano e outra em profundidade.
• XYZ aspect: cada eixo separadamente. Use-a só com muitos pares bem distribuídos.

Distribua os pares pelo volume, e em profundidades diferentes, se puder.

Enquanto você escolhe pontos, o resto do Samurai não responde ao mouse. Você ainda pode aplicar zoom e deslocar a vista. O ponteiro vira uma cruz em todo lugar.

Depois de ✓, a seção mostra Aligned · RMS com o erro de ajuste. Os pares são mantidos como histórico, e você não pode mais editá-los. ↺ Reset descarta os pares para que você possa registrar novamente. O volume permanece onde o alinhamento o colocou. Para desfazer o próprio alinhamento, use os ícones Reset das linhas Position, Rotation e Voxel size.

21.7 Gating de tiles

O Tile gating transforma uma máscara em uma lista de tiles a pular. A regra é esta: uma máscara marca onde adquirir imagens. Em cada ciclo, o Samurai compara cada tile das ROIs da máscara com a forma da máscara na profundidade desse ciclo:

• Se a máscara cobre o tile, o tile é adquirido.
• Se a máscara não cobre o tile, o tile é pulado.

Para um volume de referência, "coberto" significa que o tile contém pixels suficientemente claros:

Várias máscaras podem fazer gating ao mesmo tempo. Nesse caso, um tile só é adquirido se for coberto por todas as máscaras de gating cujo escopo inclui a ROI dele.

Ative e confira

1. Selecione a máscara e ative Tile gating em Mask Properties.
2. Escolha o ROI scope (escopo de ROIs): All ROIs ou ROIs específicas. All ROIs é o padrão e também inclui as ROIs que você adicionar depois. Esta máscara nunca afeta os tiles de outras ROIs.
3. Observe a área de visualização. Os tiles que seriam pulados recebem uma borda tracejada vermelha. Quando uma máscara de gating está visível, os tiles pulados também ficam sombreados em vermelho, e os adquiridos, em verde. Use o Time Travel para conferir alguns ciclos. A vista mostra a decisão para o ciclo exibido na tela.

Ativar o Tile gating ainda não muda nada. É apenas uma pré-visualização. A aquisição só muda quando você pressiona Sync. O sombreamento vermelho e verde é controlado por Tile Gating, no menu Overlays da área de visualização. O sombreamento só aparece quando os tiles estão sendo mostrados.

Sync: aplique a decisão

Pressione o ícone Sync ao lado da chave Tile gating, ou o ponto âmbar no cabeçalho do painel Masks. O ícone fica âmbar quando os tiles não correspondem mais às máscaras. O Samurai então faz três coisas:

1. Bloqueia a janela e mostra Syncing tile gating com um contador Z plane n / N. Ele calcula a decisão para cada ciclo, o que pode levar minutos em experimentos longos. cancela o Sync e, nesse caso, nada é alterado.
2. Define cada tile das ROIs com gating para o ciclo atual e todos os ciclos posteriores. Os tiles pulados são desativados, e os tiles cobertos são ativados. Os ciclos anteriores nunca são alterados.
3. Bloqueia as máscaras que participaram, para que a decisão delas não mude por acidente.

Um tile pulado é um tile desativado. É o mesmo que clicar em Disable tile no painel ROI. As aquisições e Capture ROI o pulam. O Sync define cada tile dentro das ROIs com gating. Por isso, ele substitui os tiles que você ativou ou desativou manualmente ali. Os tiles de outras ROIs nunca são afetados.

O ícone Sync volta a ficar âmbar sempre que a decisão pode ter mudado. Isso acontece depois que você:

• move, gira ou muda a escala de uma máscara de gating;
• edita as formas dela;
• altera as configurações de limiar ou o escopo de ROIs dela (uma nova ROI sob All ROIs também conta);
• ativa ou desativa o gating de qualquer máscara;
• exclui uma máscara de gating;
• adiciona ciclos.

Mostrar, ocultar, bloquear e alterar a opacidade não contam. Nada é aplicado automaticamente. Pressione Sync quando estiver pronto.

Para editar uma máscara sincronizada, primeiro desbloqueie-a pelo cadeado dela ou pela etiqueta Locked em Mask Properties. Faça a alteração e depois faça o Sync novamente.

Libere o gating

Para voltar a adquirir todos os tiles:

1. Desbloqueie a máscara e desative o Tile gating dela. O ícone Sync passa a oferecer a liberação (release) dos tiles. Ele também informa quantos ainda estão desativados.
2. Pressione Sync. Todos os tiles desativados nas ROIs do último Sync são ativados novamente, a partir do ciclo atual. Isso vale para todos eles, inclusive os tiles que você desativou manualmente.

Excluir uma máscara que faz gating de tiles realiza a mesma liberação como parte da exclusão. As outras máscaras de gating precisam então de um novo Sync. Excluir uma máscara que nunca fez gating de nada deixa os tiles como estão.

21.8 Bloqueie, oculte e restrinja o escopo

Bloqueie uma máscara com o cadeado na linha dela ou com a etiqueta Unlocked / Locked em Mask Properties. Você não pode mover, remodelar, registrar novamente nem excluir uma máscara bloqueada, nem alterar as configurações dela. O painel Mask Properties dela fica esmaecido. Mostrar e ocultar continuam funcionando. Cada Sync bloqueia as máscaras que participaram. Desbloqueie uma máscara para editá-la.

Oculte uma máscara com para ver as imagens por baixo. Você não pode selecionar uma máscara oculta na área de visualização, nem movê-la, girá-la ou mudar a escala dela. Mas ela continua fazendo gating.

Selection Scope (') limita os cliques na área de visualização a um único item. Restrinja o escopo a uma máscara para trabalhar nela sem tocar nas ROIs. Ou restrinja o escopo a uma ROI para alcançar os tiles que estão sob uma máscara (seção 8.5).

Desfazer. Você pode desfazer as edições de máscaras com Ctrl/⌘+Z. Isso vale para formas, quadros-chave, movimentos, configurações e alinhamento. Você não pode desfazer um Sync, a criação ou a importação de um item, nem a exclusão de um item. O desfazer não altera uma máscara bloqueada. Por isso, desbloqueie-a primeiro.

22Mapas de EDS com o Oxford AZtec

Com um detector de EDS da Oxford Instruments e o AZtec (o software de EDS da Oxford), o Samurai pode adquirir mapas de elementos de tiles escolhidos. Um mapa de elementos mostra onde está cada elemento químico. O Samurai adquire um mapa quando você pede, ou automaticamente a cada poucos ciclos durante uma aquisição. Assim, a composição fica registrada junto com as imagens de elétrons à medida que o bloco é cortado.

22.1 Antes de começar

• Um engenheiro de serviço precisa ativar o módulo EDS (Oxford AZtec) em Settings › Service › Enabled Modules. O painel EDS (AZtec) aparece então na aba Imaging.
• O computador do Samurai precisa do NanoAnalysis Plugin SDK da Oxford Instruments. Esse kit de software permite que o Samurai se comunique com o AZtec. Sem ele, a conexão falha com OINA SDK not found… Install Oxford Instruments NanoAnalysis Plugin SDK on this machine.
• O AZtec precisa estar em execução, com um projeto aberto. Defina no AZtec as configurações de mapa que você quer (faixa de energia, tempo de permanência, resolução…). O Samurai apenas inicia e interrompe as aquisições. As configurações e os dados pertencem ao AZtec.

O Samurai nunca assume o controle do AZtec. Você ainda pode usar a janela do AZtec enquanto o Samurai está conectado.

22.2 Conecte

O painel EDS (AZtec) contém:

• Acquire EDS map na posição atual.
• Edit EDS schedule.
• AZtec endpoint, o endereço do AZtec (somente enquanto estiver desconectado).
• O indicador de conexão.
• Um cartão para cada programação. Ele mostra o tile e a frequência com que ele é mapeado, com pré-visualização, habilitar/desabilitar e excluir.

1. Enquanto estiver desconectado, clique em . Informe o IP address e a Port do AZtec. Os valores padrão, 127.0.0.1 e 22201, servem para o AZtec no mesmo computador. Clique em Save.
2. Clique no indicador vermelho Disconnected. Ele mostra Connecting... em amarelo e depois Connected em verde. Se a conexão falhar, uma mensagem informa o motivo.

Para desconectar, clique no indicador verde e confirme. O Samurai não se conecta sozinho ao AZtec quando é iniciado.

22.3 Adquira um mapa manualmente

1. Leve a platina do SEM até o local que você quer mapear. Você também pode selecionar o tile na área de visualização. O AZtec então identifica o mapa com o nome do tile.
2. Clique em no cabeçalho do painel.

O Samurai adquire o mapa onde a platina está. Ele não move a platina. Se Imaging Addition estiver ativada, o Samurai primeiro eleva a platina até a posição de imageamento. Ele abaixa a platina de novo quando o AZtec informa que o mapa terminou. Enquanto o mapa é adquirido, o botão se transforma em um ícone de carregamento com Cancel EDS acquisition.

No AZtec, o mapa recebe o nome do tile selecionado, por exemplo, 12-ROI_1-A1. Se nenhum tile estiver selecionado, o AZtec numera o mapa. O AZtec pode acrescentar um número para manter os nomes únicos.

22.4 Programe mapas durante uma aquisição

Uma programação pede um mapa de um tile a cada N ciclos.

1. Com um experimento aberto, clique em Edit EDS schedule.
2. Clique em + (Add schedule). A nova linha copia o tile e o intervalo da linha anterior. A primeira linha começa com o primeiro tile da primeira ROI, a cada 10 ciclos.
3. Escolha a ROI e o Tile, e defina Every N cycles. Para pausar uma programação sem excluí-la, desmarque Enabled. Last run mostra o ciclo do último mapa.
4. Clique em Close. O Samurai salva as suas alterações imediatamente.

Cada programação também aparece como um cartão no painel:

• a habilita ou desabilita.
• a exclui imediatamente, sem perguntar antes.
• Acquire EDS preview leva a platina até aquele tile, define o campo de visão dele e adquire um mapa na hora. No AZtec, o mapa se chama preview_<tile>_<n>.

Você pode usar os cartões durante uma aquisição. As alterações valem a partir do próximo tile.

Durante uma aquisição, o Samurai verifica as suas programações depois que cada tile é adquirido. Isso acontece depois da verificação de detritos e da correção de brilho. Um mapa fica pendente se o tile nunca foi mapeado. Ele também fica pendente se tiverem se passado pelo menos N ciclos desde o último mapa do tile. Quando um mapa está pendente:

• O tile mostra o status EDS na área de visualização como um pulso azul. O cartão dele também pulsa.
• O Samurai inicia o mapa no AZtec com o nome de local (site) <tile>_c<cycle>, por exemplo, 12-ROI_1-A1_c12.
• A aquisição continua quando o AZtec informa que o mapa terminou. Se isso levar mais de 120 segundos, o Samurai interrompe o mapa e segue em frente.

A platina já está no tile e na altura de imageamento, então nada mais se move.

Se o AZtec não estiver conectado quando um mapa estiver pendente, o Samurai para e pergunta o que fazer:

• Connect now: conectar e continuar.
• Skip this one (pular este).
• Abort cycle: interromper a aquisição.

Se você não responder, o Samurai pula o mapa após cinco minutos.

Os botões de EDS ficam indisponíveis enquanto o Samurai está ocupado com o SEM ou com a platina. Isso inclui adquirir uma pré-visualização, capturar tiles, executar um ciclo, fazer uma varredura com a navalha, fazer uma aproximação rápida e mover a platina. Passe o mouse sobre um botão para ver o motivo.

22.5 Para onde vão os dados

Os mapas pertencem ao AZtec e são armazenados no projeto dele. O Samurai guarda apenas as programações, no experimento, e os nomes de local. Os nomes de local ligam cada mapa ao seu tile e ao seu ciclo.

23Automação com scripts

O Scripting (automação com scripts) permite que o Samurai faça um trabalho extra em momentos definidos de cada ciclo. Ele pode clicar em um botão no software do próprio microscópio, executar um programa Python, enviar um comando para outro instrumento ou aguardar um sinal. Uma sequência de script é uma lista de ações, mais um gatilho que diz quando a lista é executada.

Usos típicos:

• Trocar um detector ou salvar uma imagem em um software de microscópio que o Samurai não consegue controlar diretamente.
• Iniciar uma câmera externa ou um registrador de dados (um dispositivo que grava medições) antes ou depois de cada corte.
• Executar uma verificação (um script Python) e interromper a aquisição se ela falhar.
• Pausar a navalha em uma determinada posição enquanto outro dispositivo faz o seu trabalho.

23.1 O painel Scripting

O painel Scripting fica na coluna direita da aba Imaging. As sequências pertencem ao instrumento, não a um experimento, então todos os experimentos veem a mesma lista. Quando você cria ou abre um experimento, o Samurai desabilita todas as sequências habilitadas. Isso impede que a automação configurada para um experimento seja executada no seguinte. Antes de começar, habilite as sequências de que você precisa.

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1. Load script from file, + Add script sequence e Duplicate from existing script.
2. Uma sequência, com o seu nome e o indicador do gatilho: Before Cut, After Cut, Knife Threshold, Tile Arrival, ROI Arrival, Acquisition Complete ou Manual.
3. Execute now, habilitar ou desabilitar, excluir.
4. A lista expandida de ações.

• Para editar uma sequência, clique nela. Para listar as ações, clique na seta da sequência.
• Uma sequência desabilitada fica esmaecida e nunca é executada.
• exclui imediatamente, sem perguntar antes.
• Enquanto uma sequência está em execução, o seu cartão tem uma borda verde pulsante, e a ação em execução pulsa. Uma sequência que falhou pisca em vermelho, e uma mensagem informa o motivo.
• Durante uma aquisição, os botões do cabeçalho ficam indisponíveis. Os botões dos cartões continuam funcionando.

Quando você salva uma sequência, o Samurai também a grava como um arquivo .json na pasta de scripts. No Windows, essa pasta é %LOCALAPPDATA%\Samurai3\scripts. Load script from file lê esse tipo de arquivo de volta, por exemplo, em outro instrumento.

23.2 Crie uma sequência

Clique em +. O editor se abre:

Clique em Save.

Duplicate from existing script é a seta ao lado de +. Ela copia uma sequência como Duplicate of …. A cópia fica desabilitada e pronta para você adaptar.

23.3 Gatilhos

Fora de uma aquisição (por exemplo, antes e depois de uma aproximação), uma sequência só é executada se o Runs dela estiver definido como Outside acquisition ou Always. Durante uma aquisição, as sequências definidas como Outside acquisition são ignoradas. Sequências com o mesmo gatilho são executadas na ordem em que você as criou.

23.4 Ações

Retorno esperado e falhas. Nas ações Script, Serial e TCP, Expected return é a resposta que você espera. Deixe o campo vazio para não fazer nenhuma verificação. Escreva any para aceitar qualquer resposta, desde que haja uma. Para procurar um determinado texto, digite esse texto. Se a resposta estiver errada ou não chegar a tempo, On timeout/mismatch decide o que acontece:

• Stop: a sequência falha.
• Continue: o Samurai registra a falha e segue em frente.
• Retry: o Samurai tenta novamente, até o número de vezes que você definir.

Teste. As ações Script, Serial e TCP têm um botão Test. Ele executa a ação na hora e mostra um Test Log. O log mostra a resposta e se uma aquisição continuaria ou pararia.

Os scripts precisam ser arquivos Python (.py). Um script é executado na pasta em que está, e o que ele imprime é a resposta. A saída vai para o log do Samurai, não para o painel Console.

23.5 Quando uma sequência falha

• Se uma ação de uma sequência Before Cut ou After Cut falhar com Stop, a aquisição é pausada. Uma sequência Before Cut que falhou interrompe a aquisição antes de a navalha cortar. Corrija a causa e depois retome a aquisição.
• Com Continue, o Samurai registra a falha e mostra uma mensagem. A aquisição segue.
• Para os outros gatilhos, uma falha encerra aquela sequência antes do fim. A aquisição continua.

24Como trabalhar com agentes de IA

Um agente de IA pode monitorar o Samurai e, dentro dos limites que você definir, operá-lo. Um agente de IA é um assistente de programação, como o Claude Code, o Cursor ou o Codex. Ele pode ser executado neste computador ou em outro. O Samurai oferece ao agente um conjunto de ferramentas por meio do MCP (Model Context Protocol, uma forma padronizada de os agentes de IA usarem ferramentas). Um uso típico é um observador. Ele verifica uma aquisição longa a cada poucos minutos e examina as imagens mais recentes. Se algo der errado, ele interrompe a aquisição ou avisa você.

Nenhum modelo de IA é executado dentro do Samurai. O agente é um programa separado, que você mesmo instala e paga. O Samurai apenas responde às solicitações dele.

24.1 Conecte um agente

O botão Connect an AI agent (conectar um agente de IA) fica no rodapé, em todas as abas.

1. Clique em Connect an AI agent.
2. Marque Enable MCP server (ativar o servidor MCP). A Port (porta) é 8765, a menos que você a altere. O indicador no rodapé passa a mostrar MCP com um ponto verde.
3. Escolha o seu programa em Client (cliente). O painel mostra as linhas exatas para configurá-lo. Para o Claude Code, por exemplo, ele mostra um comando claude mcp add …. Clique no botão de copiar ao lado de uma linha e cole-a onde o painel indicar.
4. Inicie o seu agente e peça a ele que se conecte ao Samurai.

O servidor aceita conexões somente deste computador. Cada vez que o Samurai é iniciado, ele gera um novo token de pareamento. É um código secreto que fica dentro do endereço que você copia. Depois de reiniciar, copie a nova linha para o seu agente novamente. Um agente em outro computador se conecta por um túnel SSH (uma ligação segura entre dois computadores). Keep watching (continuar monitorando) fornece o comando.

Agent activity (atividade dos agentes) lista o que os agentes fizeram, do mais recente para o mais antigo. O console também registra cada solicitação de agente e cada decisão.

24.2 Permissões

As Agent permissions (permissões do agente) no painel decidem o que um agente pode fazer. Há duas linhas.

Imaging & Approach: um único modo vale para as duas abas.

Studio: Ask every time (perguntar sempre; é o padrão) ou Always allow (sempre permitir). Com Ask every time, cada alteração em um projeto do Studio pede a sua autorização primeiro. Ler um projeto nunca pede autorização.

Algumas coisas nunca ficam disponíveis para um agente, em nenhum modo. São as atualizações de firmware, a proteção da navalha, os modos dummy e de serviço e as limpezas forçadas. Também entram nessa lista a exclusão de experimentos, os comandos seriais diretos e os scripts, os limites da platina, a janela de corte e os cliques na interface do usuário.

O pedido de aprovação

Quando um agente solicita algo que precisa da sua aprovação, uma caixa de diálogo aparece em qualquer aba. O título é Agent requests an Imaging hardware action (ou …change, quando se trata de uma alteração). A caixa mostra qual ferramenta o agente usou, o que ele quer fazer e por quê. As ações de hardware aparecem em âmbar.

• Allow once executa aquela única solicitação.
• Deny recusa a solicitação. A partir daí, a mesma solicitação é recusada pelo resto da sessão. Fechar a caixa de diálogo também a recusa.
• Se você não responder em 120 segundos, a solicitação não é executada.

No Studio, a caixa de diálogo também oferece Always allow. Essa opção muda a linha Studio para Always allow.

24.3 O que um agente pode fazer

Algumas etapas devem continuar sendo suas: conectar os equipamentos, criar o experimento que você realmente vai executar, desenhar ROIs e gerar ciclos. Se um agente perceber algo nessas etapas, ele relata isso no console em vez de agir.

24.4 Mantenha um agente monitorando uma aquisição

Uma janela de chat não mantém um agente trabalhando por dias. Para monitorar uma aquisição longa de forma confiável, use uma verificação agendada. A cada poucos minutos, o agendador do seu computador inicia o agente para uma passada curta. Cada passada lê o monitoring brief do Samurai, que diz ao agente o que verificar. O agente se atualiza sobre os eventos e as imagens, grava as suas anotações e relata qualquer coisa preocupante. Depois, ele termina.

Abra Keep watching no painel. Ali há linhas prontas para o seu cliente:

• One pass, headless: uma única verificação, executada sem janela de chat.
• Every 5 min (scheduler): uma linha para o Agendador de Tarefas do Windows ou para o cron no macOS e no Linux.
• From another machine (SSH tunnel first): para um agente em outro computador.

Durante uma aquisição, o indicador mostra se um agente ainda está monitorando:

• Depois de 3 minutos sem nenhuma chamada do agente, ele mostra agent quiet N min em âmbar.
• Depois de 10 minutos, ele mostra agent silent N min em vermelho, com a mensagem The AI agent has stopped watching the run (o agente de IA parou de monitorar a aquisição).

O Samurai não consegue reiniciar um agente por conta própria. Verifique o agendador do agente.

25Samurai Studio

O Samurai Studio é onde você trabalha com as suas imagens, durante ou depois da aquisição. Você pode alinhá-las e unir (stitching) os tiles em uma única imagem. Pode limpá-las e realçá-las, e segmentar estruturas (demarcar partes como células). Também pode medi-las, visualizá-las em 3D e exportá-las. O Studio é executado dentro do Samurai, em uma aba própria. Ele nunca altera os dados adquiridos. Tudo o que você faz fica guardado em um projeto do Studio.

25.1 Ative o Studio

O Studio é um módulo opcional. Para ativá-lo:

1. Clique na engrenagem no rodapé. Abra Service e ative Service Mode (modo de serviço). Para isso, você precisa de uma senha.
2. Abra Enabled Modules (módulos ativados) e ative Studio.

Um botão Studio () aparece no seletor de abas, no topo da janela. Se você desativar o módulo com o Studio aberto, o Samurai leva você de volta à aba Approach.

25.2 O espaço de trabalho

• Para redimensionar uma barra lateral, arraste a borda dela (240–420 px). Para recolhê-la, clique na seta no canto inferior dela. Em uma janela estreita, as barras laterais se recolhem sozinhas.
• Sem nada selecionado, o Workbench mostra Select an image to see details (selecione uma imagem para ver os detalhes). Para ver as ferramentas de uma imagem, selecione-a no Explorer ou na área de visualização.
• No modo 3D, a barra lateral esquerda fica oculta e o Workbench mostra os controles da vista 3D (capítulo 31, “Vistas 3D e exportação”).

Etiqueta de status. Uma etiqueta arredondada no topo da área de visualização informa o que o Studio está fazendo:

Rodapé. Os trabalhos longos mostram o seu progresso à esquerda do rodapé, por exemplo Importing — packaging… 3/12. Search (Ctrl+K) abre o Spotlight, que encontra qualquer coisa no Studio enquanto você digita (capítulo 32, “Spotlight e agentes no Studio”).

25.3 Projetos

Um projeto do Studio é uma pasta. Ela contém um arquivo de banco de dados, project.sqlite, e as imagens que o Studio gravou. Você não pode importar nada enquanto não houver um projeto aberto.

Crie um projeto

1. No painel Project, clique em + (New Studio project).
2. Digite um Project Name (nome do projeto). Clique em (Select project folder) e escolha onde criar o projeto. O Studio o cria como uma subpasta com o nome do projeto.
3. Clique em ✓ (Create project).

Se a pasta já contiver um projeto, o Studio a recusa. Nesse caso, abra esse projeto.

Abra um projeto. Clique em (Load Studio project). Escolha a pasta do projeto ou o project.sqlite dela. O painel passa então a mostrar o nome e o caminho do projeto.

Reabertura. Quando o Samurai é iniciado novamente, o Studio reabre o projeto que você tinha aberto. Ele mostra Reopened Studio project "…".

Salvamento. Não há botão Save. O Studio salva o projeto cerca de um segundo após cada alteração. Se o salvamento falhar, o painel Project mostra Save failed (falha ao salvar) com Retry (tentar novamente). Após duas falhas seguidas de salvamento, o Studio não inicia novos trabalhos até que o projeto possa ser salvo novamente.

Recuperação. Quando um projeto é aberto, o Studio faz uma limpeza após qualquer travamento. Ele conclui as operações que foram interrompidas durante a aplicação. Ele mantém os resultados que estavam completos no disco e remove as sobras gravadas pela metade. Se o banco de dados estiver danificado, o Studio o reconstrói automaticamente. O arquivo danificado é mantido ao lado dele como project.sqlite.corrupt-….

O que há em uma pasta de projeto

Um experimento transmitido não é copiado. O Studio o lê onde ele está, no acquisition.zarr do experimento, e nunca grava ali (seção 26.1).

25.4 Campos de arraste e desfazer

No Studio, você edita números em campos de arraste (scrub fields), da mesma forma que na aba Imaging:

• Arraste o ícone ou o rótulo do campo para a esquerda ou para a direita para alterar o valor. Mantenha Shift pressionada para passos dez vezes mais finos. Em um campo sem ícone, você só pode digitar.
• Clique no valor para digitar um novo. Enter ou um clique fora do campo aplica o valor. Esc cancela.

Desfazer e refazer. Ctrl/⌘+Z desfaz. Ctrl/⌘+Shift+Z ou Ctrl/⌘+Y refaz. Os botões na extremidade direita da barra de ferramentas da área de visualização fazem o mesmo. O Studio guarda até 50 etapas. As alterações feitas em menos de um terço de segundo contam como uma só etapa. O desfazer cobre o documento: posições, nomes, ordem dos quadros, visibilidade e anotações.

O processamento não é desfeito dessa forma. Cada operação cria uma nova versão. Para voltar atrás, você ativa a versão anterior, isto é, faz dela a versão em uso. Quando não há mais nada a desfazer, Ctrl/⌘+Z faz exatamente isso (seção 28.3). O desfazer fica indisponível enquanto uma operação está aberta ou em execução, e enquanto as imagens estão sendo carregadas.

26Como trazer dados para o Studio

O Studio trabalha com pilhas. Uma pilha é uma lista ordenada de quadros, e cada quadro contém uma ou mais imagens. Uma pilha pode vir de um experimento do Samurai, transmitida ao vivo enquanto é adquirida. Ela também pode vir de arquivos de imagem.

26.1 Transmita um experimento

Para trazer os dados do próprio Samurai para o Studio, transmita (stream) o experimento para um projeto. O experimento inteiro se torna uma única pilha, com um quadro por ciclo (Cycle 1, Cycle 2…). Cada quadro contém uma imagem por ROI (ROI_1 · Cycle 1…), cada uma na sua própria posição da platina. Nada é copiado. O Studio lê o repositório de imagens do experimento (os arquivos que guardam as imagens dele) onde ele está. Ele nunca grava nesse repositório.

1. Abra ou crie um projeto do Studio para o experimento.
2. Abra o experimento na aba Imaging.
3. No Studio, ative Stream experiment to project (transmitir o experimento para o projeto) no cabeçalho do Explorer. O ícone fica azul.

Você também pode clicar em Import folder (importar pasta) e escolher a pasta do experimento. O Studio a reconhece e começa a transmissão imediatamente. Se você escolher uma pasta dentro de um experimento, a caixa de diálogo de importação informa This folder is part of a Samurai acquisition. (esta pasta faz parte de uma aquisição do Samurai). Em seguida, ela oferece Stream full experiment (transmitir o experimento inteiro).

Enquanto a aquisição continua, os novos ciclos aparecem como novos quadros. O Studio procura por eles a cada poucos segundos. Uma ROI adicionada durante a aquisição preenche os seus ciclos. As imagens que ainda estão sendo gravadas são atualizadas quando ficam completas. Os quadros são carregados quando você os olha pela primeira vez. Até lá, o ícone deles é um ponto cinza.

• Pause a transmissão desligando-a. Ligue-a novamente para recuperar o atraso. Nada é perdido nem duplicado.
• Se você excluir um quadro de ciclo no projeto, ele nunca volta, mesmo que cheguem mais ROIs para ele.
• Na primeira transmissão para um projeto vazio, o Studio define o Delta Z (o espaçamento entre os cortes) a partir da espessura de corte do experimento.
• Se a pasta do experimento for movida ou desaparecer, o Explorer mostra Stream unavailable… (transmissão indisponível) e continua tentando alcançá-la. Os quadros que ainda não foram carregados não podem ser carregados até que a pasta volte.

26.2 Importe arquivos de imagem

Os botões de importação ficam no cabeçalho do Explorer. Você pode usá-los quando há um projeto aberto.

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1. + New frame: adiciona um quadro vazio.
2. Import image file(s).
3. Import folder.
4. Stream experiment to project.
5. Uma pilha: o seu código de versão, o nome e o número de quadros.
6. Os quadros da pilha expandida.
7. O conteúdo do quadro atual.

Um arquivo. Clique em e escolha um arquivo TIFF, PNG, JPEG, WebP ou BMP. Você também pode arrastar arquivos para a aba Studio (Drop images to import, solte as imagens para importar). Se você soltar arquivos sem nenhum projeto aberto, o Studio primeiro pede que você crie um.

• Um TIFF de várias páginas se torna uma pilha própria, com o nome do arquivo e um quadro por página.
• Uma imagem única é adicionada ao quadro atual da pilha ativa. Se o quadro já tiver uma imagem, a nova é colocada por cima, como overlay (camada sobreposta). Se não houver pilha ativa, a imagem se torna um item próprio.

Vários arquivos ou uma pasta. Se você escolher vários arquivos, uma caixa de diálogo de seleção se abre. O mesmo acontece com Import folder, que também procura em subpastas.

A lista mostra o que será importado. Import cria uma pilha, com o nome da pasta, na ordem mostrada. Cada página de um arquivo de várias páginas se torna uma entrada própria.

Com Import as mosaic tiles, Load tile positions… (carregar as posições dos tiles) lê as posições dos tiles de um arquivo. Pode ser um arquivo de texto (caminho, x, y e, opcionalmente, z), um TileConfiguration.txt do Fiji ou um projeto TrakEM2. Defina também o Pixel size e se as coordenadas indicam o Top-left corner (canto superior esquerdo) ou o Tile center (centro do tile). Se o layout sair espelhado, use Swap X/Y, Invert X ou Invert Y.

O que é copiado. O Studio converte os arquivos importados para dentro do projeto (assets/stacks). Assim, o projeto continua funcionando se os originais forem movidos. Deixe livre um espaço em disco de aproximadamente o tamanho dos dados. Os arquivos exportados pelo Samurai trazem de volta os seus metadados, ou seja, as informações salvas com cada imagem. Isso inclui posição, tamanho do pixel, configurações de exibição, anotações, nomes dos quadros e classes do classificador. Os arquivos sem metadados recebem um tamanho de pixel de 10 nm e a posição 0, 0. Eles ficam marcados como não calibrados.

26.3 Calibre a posição e o tamanho do pixel

Distâncias, a barra de escala e as vistas 3D precisam do tamanho do pixel correto. Enquanto uma imagem não está calibrada, o rótulo do tamanho do pixel em Properties fica âmbar.

1. Selecione a imagem. Na seção Properties, clique em Edit properties (editar propriedades).
2. Clique no valor de Pixel size e digite o tamanho. A unidade pode ser nm, µm ou mm. Clique na unidade para alterá-la.
3. Ajuste a Position X e Y. Você pode digitar os valores, arrastar os rótulos X / Y ou arrastar a imagem na área de visualização.
4. Clique em ✓ Apply changes (aplicar as alterações). ✕ descarta as alterações.

O tamanho do pixel vale para todas as imagens da pilha. Em uma pilha transmitida, isso significa todas as ROIs. A posição vale somente para a imagem selecionada. Essas edições não criam uma nova versão. Em vez disso, a linha da versão no painel Version mostra · calibrated. Alterar o tamanho do pixel muda a escala física, não o número de pixels. Para reamostrar (mudar o número de pixels), use Adjust › Resize. Com várias imagens selecionadas, Properties mostra os valores delas, mas você não pode editá-los ali. Onde os valores diferem, aparece Mixed (misto).

A ferramenta Crop (recortar) também fica no modo de edição (seção 27.4). Aplique o recorte como uma etapa à parte, antes ou depois de calibrar.

26.4 O Explorer

O Explorer lista as pilhas do projeto. Mais exatamente, ele lista as versões que você está vendo:

• A versão ativada (a que está em uso no momento).
• As versões que você selecionou.
• As versões que você mantém visíveis com o olho no painel Version (capítulo 28, “Processamento e versões”).

Para mostrar os quadros de uma pilha, clique na seta dela.

Ícones de status dos quadros

A linha de um quadro também mostra um resumo, como 2 ROIs, 3 tiles ou 1 image + 1 overlay. Um lápis verde significa que o quadro tem rótulos pintados do classificador. Abaixo da lista, o conteúdo do quadro atual lista as suas imagens e anotações. Passe o mouse sobre um item para ver centralizar, mostrar/ocultar e excluir.